Developmet of cationic liposome with hyaluronic acid for gene therapy

Esta pesquisa visou o desenvolvimento de lipossomas catiônicos contendo o DNA plasmideal e recobertos com o ácido hialurônico, para o desenvolvimento de novas estratégias de vacinas gênicas. Os lipossomas foram compostos dos lipídios: fosfatidilcolina natural de ovo (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) e 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP). A primeira etapa, avaliou-se a influência do tipo de lipossoma (extrudado ou DRV - "Dehydrated-rehydrated") e de duas massas molares de ácido hialurônico (HA 6 e 16 kDa) nas propriedades dos complexos finais. Lipossomas extrudados apresentaram diâmetro médio reprodutível, quando comparado com lipossomas do tipo DRV. Surpreendentemente, complexos formados por lipossomas extrudados e HA 16 kDa apresentaram diâmetro na faixa nanométrica (200-400nm). Na segunda etapa, estudou-se o efeito da incorporação de um DNA modelo nas estruturas contendo HA e lipossomas catiônicos através da construção do perfil de diâmetro médio e potencial zeta em função da razão molar entre as cargas positivas (dos lipídeos catiônicos) e das cargas negativas proveniente do DNA (R+/-). A proporção escolhida foi R+/- = 3, pois permite toda a incorporação do DNA na estrutura lipossomal. Estudos de transfecção mostraram que a presença do HA nas estruturas eleva a eficiência de transfecção em células HeLa, porém de forma independente da quantidade de HA. A partir destes estudos, amostras contendo LACKDNA/Lipossomas catiônicos/HA foram preparadas e enviadas para estudos in vivo no Laboratório de Imunofarmacologia - Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ para avaliação da capacidade destas nanoestruturas na vacinação contra a Leishmaniose.This research has the goal of develop a vaccine composed of liposome containing DNA and covered by hyaluronic acid as a new strategy for gene delivery. The hyaluronic acid is a natural polysacaride with mucoadhesive properties and has been used in vaccines using nasal route. This biopolymer allows the increase in the gene delivery in liposome systems because it has specific sinals for the cells, CD44 and RHAMM. The liposomes use in this research are composed of egg phosphatidylcholine(EPC), 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane(DOTAP), l-alpha-dioleoyl phosphatidylethanolamine(DOPE), and hyaluronic acid used was of low molecular weight (6 and 16 kDa). The first step study the influence of the kind of liposome (extruded liposome or DRV - "Dehydrated-rehydrated") and polymer mplecular weight. The final properties of the systems were checked. Extruded liposomes show diameter results more reproductive compared to DRV. The complexe of HA 16 kDa and extruded liposomes has the diameter in the nano scale (200-400 nm). The morphology of these complexes indicat the HA is covering the liposome. In a second step study the DNA incorporation in liposome using the construction of diameter and zeta potential profile in function of molar charge ratio ( positive molar charge from cationic lipid/ molar negative charge ratio from DNA).The best molar charge ratio considered was 3 for futher studies with liposome , DNA and HA. Transfection studies demonstrated that the HA presence increase the eficience of gene delivery in HeLa cells, no matter the amount of HA. Using this study, the structures composed of liposome/LACKDNA/HA, are prepared to be used in in vivo and in vitro studies of Leishmanioses in the Carlos Chagas Institute/UFRJ