Identification of differently expressed proteins in deep venous thrombosis patients

A trombose venosa profunda (TVP) é uma doença multifactorial, e possui uma alta taxa de morbi-mortalidade devido a complicações como embolia pulmonar e a síndrome póstrombótica, e cerca de 25 % dos pacientes apresentarão recorrência em 5 anos. A identificação de novos fatores envolvidos na fisiopatologia da TVP pode ser convertida em implicações de grande importância no manejo destes pacientes, prevenção de recorrência e no desenvolvimento de novas terapias. O interesse em avaliar as plaquetas e as amostras de plasma se deve ao fato de que as funções plaquetárias não estão completamente compreendidas, e aparentemente o papel das plaquetas poderia ir além do seu envolvimento na hemostasia. Como o plasma potencialmente fornece uma janela para a observação do indivíduo como um todo, a análise proteômica tanto das plaquetas como do plasma poderia implementar o nosso conhecimento acerca da fisiopatologia da TVP. OBJETIVO: Neste estudo foram analisados os perfis proteicos de plaquetas e amostras de plasma de três pacientes com TVP, que foram comparados com os resultados obtidos a partir de amostras de 1 irmão e 1 vizinho para cada paciente, a fim de minimizar as interferências genéticas e ambientais. Estes pacientes apresentaram episódios espontâneos e recorrentes de TVP proximal e mencionaram um histórico familiar de distúrbios da coagulação. MÉTODOS: as plaquetas necessitaram ser lavadas e lisadas, e as amostras de plasmas tiveram a albumina depletada antes de as proteínas serem alquiladas, reduzidas, precipitadas com acetona e hidrolisadas com tripsina. Os peptídeos das plaquetas e das amostras de plasma foram fracionados por cromatografia de fase reversa e troca catiônica, respectivamente. Depois disto, os peptídeos plaquetários foram direcionados ao espectrômetro de massas LTQOrbitrap e a busca das proteínas foi realizadas através do Sorcerer/Sequest. Os peptídeos plasmáticos foram encaminhados ao espectrômetro de massas ESI Q-TOF Premier e as proteínas foram analisadas pelo Mascot. RESULTADOS: Cinco proteínas estiveram presentes apenas nas plaquetas dos pacientes, estando ausentes em todos os controles: a proteína ligante da Apolipoproteína A1, a sub-unidade ?1 do Coatômero, a Desidrogenase 11-17-? do Estradiol, a Leucotrieno A-4 Hidrolase e a Sorbitol Desidrogenase. Além disso, verificou-se que outras proteínas estiveram diferencialmente expressas em amostras de plasma pacientes e controles: a protease C4-A, o inibidor C1 da Inter-?-Tripsina, o inibidor H1 de cadeia pesada, a proteína Amilóide Sérica A, a glicoproteína ?-2-HS, a isoforma 2 da inter- ?-tripsina, a apolipoproteína A-IV e o inibidor de cadeia pesada H4. CONCLUSÕES: A avaliação de plaquetas e amostras de plasma de pacientes com TVP espontânea permitiu a identificação de proteínas diferencialmente expressas quando comparados a irmãos e vizinhos, que podem desempenhar importantes papéis na fisiopatologia da doença por se relacionarem a processos inflamatórios, imunes e no de transporte de lipídeos.Deep venous thrombosis (DVT) is multi-causal disease associated to a high morbimortality due to complications as pulmonary embolism and post-flebitic syndrome, and about 25 % of the patients present recurrence in 5 years. The identification of new factors involved to the physiopathology of DVT can be translated into important implications for the management of these patients, prevention of recurrence, and for the development of new therapies. We were interested about platelets and plasma because the platelets functions are not completely understood and apparently their role goes beyond a hemostatic player, and as the plasma potentially provides a window into the individual's state of health and disease, both could improve our knowledge about the DVT physiopathology. AIM: In this study we analyzed the protein profile of platelets and samples of plasma of 3 DVT patients and compared to results obtained from 1 sibling and 1 neighbor for each patient in order to minimize the genetic and environmental interferences. These patients presented spontaneous and recurrent episodes of proximal DVT and mentioned a familiar history of coagulation disorders. METHODS: the platelets needed to be washed and lysed, and the plasmas samples required albumin depletion before the proteins being alkylated, reduced, precipitated with acetone and hydrolyzed by trypsin. The peptides were fractionated by reverse phase and cation exchange liquid chromatography for platelets and plasmas samples, respectively. After that, the platelets peptides were directed to LTQ-Orbitrap mass spectrometer and the proteins search were performed by Sorcerer/Sequest. The plasma peptides went to ESI Q-TOF Premier mass spectrometer and the proteins were searched by RESULTS: We identified 5 proteins that were present on platelets from patients and absent in all the controls: Apolipoprotein A1 Binding-Protein, Coatomer (?1 sub-unit), Estradiol 11-17-? Dehydrogenase, Leukotriene A-4 Hydrolase and Sorbitol Dehydrogenase. In addition, we verified 6 proteins that were differently expressed between patients and controls: C4-A plasma protease, C1 inhibitor Inter-alpha-trypsin, inhibitor heavy chain H1, the serum amyloid A, alpha-2-HS-glycoprotein, isoform 2 of inter-alphatrypsin, apolipoprotein A-IV and the inhibitor heavy chain H4. CONCLUSIONS: The evaluation of platelets and plasma samples from patients with spontaneous DVT allows the identification of proteins that are differently expressed when compared to siblings and neighbors, which can play important roles on the physiopathology of the disease due their relation to inflammatory, immune and lipid transportation