Digestome analysis from lower termite Coptotermes gestroi aiming at lignocellulosic bioproducts development

Os bioprodutos derivados de resíduos lignopolissacrídico, entre eles o etanol de segunda geração ou bioetanol lignocelulósico, são considerados um produto energético sustentável, sendo a transformação dos polissacarídeos da parede celular vegetal em açúcares fermentáveis, um dos principais desafios desta cadeia produtiva. O uso de enzimas (hidrolases glicolíticas) neste procedimento é de extrema importância e a descoberta e caracterização de novas hidrolases serão de grande avalia para o melhoramento e desenvolvimento dessa atividade econômica. Cupins exercem um papel importante na ciclagem de carbono e nitrogênio no meio ambiente. Responsabilizando-se por cerca de 90% da degradação da matéria vegetal-seca em florestas tropicais, os cupins são considerados ecologicamente como um biorreator natural de transformação de materiais lignocelulósicos em açúcares. Seu "arsenal" enzimático (endógeno e simbiôntico) é uma fonte de enzimas que agem em um sinergismo eficiente e que deve ser estudada visando a sua aplicação biotecnológica (Digestoma). O objetivo desse dissertação foi de obter informações sobre o digestoma de C. gestroi, em particular identificando hidrolases glicolíticas (polissacaridases) desse digestoma por abordagens de bioquímica e metaproteômica, além de caracterizar funcionalmente cinco hidrolases glicolíticas e enzimas acessórias do cupim C. gestroi identificados em seu metranscriptoma. A caracterização bioquímica do extrato bruto protéico de C. gestroi mostrou que o mesmo é capaz de hidrolisar diferentes tipos de ligações glicosídicas em diversos substratos polissacarídeos naturais em diversos pH diferentes (pH 4 - pH 8). A análise do metaproteoma identificou cerca de 55 proteínas com similaridades com hidrolases glicolíticas, sendo a ocorrência dessas proteínas validadas funcionalmente como dados de ensaios enzimáticos e análise de eletroforese capilar. A caracterização funcional de uma Endo-ß-1,4-glicosidase (EG1Cg - GH9) e uma ß-1,4-glicosidase (BG1Cg - GH1) endógenas que as enzimas possui uma atividade ótima em pH em torno de pH 5-6, a temperatura ótima de atividade foi em torno de 50-55 ºC, além de a cinética enzimática revelar um padrão michaeliano para as enzimas. O modo de operação dessas enzimas são conservados, bem como sua estrutura tridimensional e resíduos catalíticos. Concluímos que o cupim Coptotermes gestroi possui as principais classes de hidrolases glicolíticas envolvidas na degradação da biomassa vegetal, sendo essas enzimas de grande potencial biotecnológico.The bioproducts derived from lignopolissascharides residues, such as, second-generation ethanol or lignocellulosic bioethanol, are considered a sustainable energy product, and the transformation of plant cell wall polysaccharides into fermentable sugars, one of the main challenges to enhance productivity of this bioproduct. The use of enzymes (glycoside hydrolases) in this procedure is substantial and discovery and characterizations of new hydrolases are high rating for the improvement and development of this economic activity. Termites play an important role in the cycling of carbon and nitrogen in the environment. They are responsible for about 90% o plant matter-dry degradation in tropical forests. Termites are ecologically considered as a natural bioreactor for conversion of lignocellulosic materials into sugar. It enzymatic repertoire (endogenous and symbiotic) is a source of enzymes that act in a effective synergism and should be studied to determine whether its biotechnological application. Initially, the aim of this thesis was to obtain information about the digestoma of lower termite Coptotermes gestroi, particularly the glycoside hydrolases (polissacharidases) by a biochemical and metaproteomic approach and the secondly aim were characterize functionally five enzymes from C. gestroi digestome (glycoside hydrolases and accessory proteins). Biochemical characterization of crude extract protein from C. gestroi showed that it is able to hydrolyze glycosidic linkages of different types in different natural polysaccharide substrates in several different pH (pH 4 - pH 8). The analysis of metaproteoma identified about 55 proteins with similarities to glycoside hydrolases, and the occurrence of these proteins were functionally validated with biochemical assays and capillary electrophoresis. The functional characterization of endogenous endo-ß-1,4- glucosidase (CgEG1 - GH9) and a ß-1 ,4-glucosidase (CgBG1 - GH1) from C. gestroi showed the optimum pH of activity around pH 5.6 , the optimum temperature for activity was around 50-55 °C, further than enzyme kinetics reveal a pattern michaeliano for enzymes. The modes of operation of these enzymes are conserved, as well as their three-dimensional structure and catalytic residues. Thus we conclude that the lower termite Coptotermes gestroi has the major classes of hydrolases involved in the glycolytic degradation of plant biomass being these enzymes of great biotechnological potential