Correlation between nitrogen metabolism, synthesis of phenylpropanoids and production of nitric oxide Arabidopsis thaliana

A nitrato redutase (NR) corresponde ao primeiro passo na assimilação do nitrato em plantas. Recentemente, essa enzima tem sido também relacionada à síntese de óxido nítrico (NO). Entre várias ações sinalizadoras para as plantas, o NO promove o acúmulo de fenilpropanóides pela ativação da expressão de enzimas iniciais dessa via. Contudo, uma correlação entre metabolismo de nitrogênio, emissão de NO e acúmulo de fenilpropanóides não foi estabelecida. Por isso, neste trabalho foi analisado o efeito do suprimento de nitrato e da deficiência na NR sobre a síntese de aminoácidos, a emissão de NO e o metabolismo de fenilpropanóides em diferentes tecidos de Arabidopis thaliana selvagem e mutante duplo deficiente para a NR (nia1 nia2). Análises cromatográficas mostraram que a mutante é deficiente na síntese de sinapoil malato (SM), fenilpropanóide predominante nas folhas, resultando no acúmulo de seu precursor sinapoil glicose (SG) e derivados de kaempferol. Essa deficiência não foi causada pela baixa assimilação do nitrato, já que a recuperação do conteúdo de aminoácidos na mutante não alterou seu perfil metabólico. Porém, a maior disponibilidade de nitrato aumentou a atividade da NR, a emissão de NO e os níveis de SM e diminuiu os níveis de SG, nos dois genótipos. O cultivo in vitro da mutante na presença de malato afetou a produção de SM de maneira dose-dependente, enquanto substâncias doadoras de NO causaram apenas um pequeno aumento em SG. Porém, a combinação malato/doador de NO promoveu a recuperação de SM ao nível da selvagem. Esse efeito sinergístico do NO com o malato também ocorreu quando as folhas da mutante foram infiltradas com esses compostos. Além disso, a atividade da enzima sinapoil glicose:malato sinapoil transferase (SMT) foi menor na mutante e a adição de NO aumentou a síntese de SM. Ainda, as folhas da mutante foram incapazes de acumular antocianinas sinapoiladas ao nível da selvagem quando submetidas a um estresse luminoso. Nos botões florais apenas derivados de kaempeferol e quercetina foram identificados e não houve diferença entre selvagem e mutante. Nas raízes não foram identificados fenilpropanóides, provavelmente porque esses compostos só são acumulados nesse órgão na presença de luz. Em relação ao acúmulo de aminoácidos, as folhas do mutante apresentaram níveis reduzidos de todos os aminoácidos parecendo atuar como fonte desses compostos para os botões florais, que não apresentaram nenhuma diferença em relação à selvagem. A glutamina recuperou os níveis de aminoácidos nas folhas, mas não causou diferença nos botões florais. Nas raízes, não houve diferença no conteúdo de aminoácidos entre selvagem e mutante, quando cultivadas no solo, mas in vitro, a mutante foi deficiente, provavelmente pela limitação de nutrientes nessa condição. Esses resultados indicam que o metabolismo dos ésteres de ácido sinápico nas folhas, controlado por aciltransferases dependentes de sinapoil glicose, está comprometido no mutante nia1 nia2 e sugere um potencial papel sinalizador para o NO na ativação dessas aciltransferases. Ainda, o efeito da deficiência na NR nos níveis de aminoácidos parece alterar as relações de fonte e dreno na planta e a folha foi o órgão mais afetado.The nitrate reductase (NR) is the first step in nitrate assimilation in plants. Recently, this enzyme has also been related to the synthesis of nitric oxide (NO). Among various signaling actions for plants, NO promotes the accumulation of phenylpropanoids by activating the expression of the initial enzymes of this pathway. However, a correlation between nitrogen metabolism, NO emission and accumulation of phenylpropanoids has not been established. Therefore, this work analyzed the effect of nitrate supply and NR deficiency on the synthesis of amino acids, emission of NO and phenylpropanoid metabolism in different tissues of wild type and NR double-deficient (nia1 nia2) Arabidopsis thaliana plants. Chromatographic analysis showed that the mutant is deficient in the synthesis of sinapoylmalate (SM), the major phenylpropanoid in the leaves, resulting in accumulation of its precursor sinapoylglucose (SG) and kaempferol derivatives. This deficiency was not caused by the low nitrate assimilation, since the recovery of the amino acid content in the mutant did not change its metabolic profile. In contrast, an increased supply of nitrate enhanced NR activity and NO production, and increased SM and decreased SG levels in both genotypes. The in vitro cultivation of mutant in the presence of malate affected the production of SM in a dose-dependent manner, whereas NO donors caused only a slight increase in SG. However, the combination of malate/NO donor promoted the recovery of SM at the level of wild type plants. The synergistic effect of NO with malate in the recovery of SM also occurred when the mutant leaves were infiltrated with these compounds. Furthermore, sinapoylglucose:malate sinapoyltransferase (SMT) activity was reduced in the mutant, and the addition of NO increased SM synthesis. Additionally, mutant leaves were unable to accumulate sinapoylated anthocyanins at the level of wild type when exposed to light stress. In the flower buds just kaempeferol and quercetin derivatives were identified and there was no difference between wild type and mutant. In the roots, phenylpropanoids were not identified, probably because these compounds are accumulated in this organ only in the presence of light. Regarding the accumulation of amino acids, the mutant leaves showed reduced levels of all amino acids and appeared to act as a source of these compounds to the flower buds that showed no difference from the wild plant. Glutamine recovered the amino acid levels in leaves, but caused no difference in flower buds. In the roots, there was no difference in the amino acid content between wild type and mutant, when grown in soil, but in vitro, the mutant was deficient, probably due to nutrient limitation in this condition. These results indicate that hydroxycinnamate ester metabolism in leaves, controlled by the sinapoylglucose-dependent sinapoyltransferases, is compromised in nia1 nia2 mutant and suggests a potential signaling role for NO in the activation of these acyltransferases. Additionally, the effect of NR deficiency in the levels of amino acids appears to alter the relationship of source and sink in the plant and the leaf is the most affected organ