Kinetics of calcium and fluoride binding to the surface of streptococci and the importance of these ions as mineral reservoirs in dental biofilm

O estudo das formas de retenção de íons no biofilme dental e dos mecanismos de disponibilização destes para o fluido do biofilme é importante para o entendimento do papel destes reservatórios em interferir na dinâmica do processo de formação da cárie dental. Sabe-se que o fluoreto (F) está ligado ao biofilme por interação com íons cálcio (Ca). Um dos reservatórios que estes dois íons podem formar é o F ligado ao Ca na superfície de bactérias e proteínas da matriz extracelular. Quando o pH do biofilme diminui após a exposição à carboidratos fermentáveis, a liberação destes íons poderia diminuir o potencial de perda mineral, mas isto não está claro na literatura. Além disso, há evidências de que um pré-bochecho com Ca aumente a retenção de F no biofilme e entender a cinética de ligação e liberação destes íons pode ser uma estratégia importante para o desenvolvimento de métodos que os mantenham por mais tempo no biofilme dental. Assim, o objetivo deste trabalho de tese foi estudar a cinética de ligação de Ca e F na superfície bacteriana e sua liberação em função do tempo e do pH do meio. A bactéria Streptococcus mutans cepa IB 1600 foi utilizada em todos os experimentos. Foram realizados experimentos sequenciais in vitro para avaliar a cinética de ligação e liberação de Ca à superfície de S. mutans utilizando soluções contendo 0 (controle), 1 ou 10 mM de Ca. A capacidade de liberação deste reservatório também foi avaliada em situação que simula a queda do pH. Além disso, foi avaliada a capacidade e cinética de ligação de F, na concentração de 52,6 ?M F (1 ppm F), mediada por Ca, às bactérias. A quantidade de Ca e F ligada às bactérias foi estimada após extração desses íons da superfície bacteriana com ácido forte, utilizando dosagem colorimétrica e eletrodo íon-específico, respectivamente. Curvas e parâmetros de cinética de ligação e liberação foram calculados e avaliados como fenômenos bioquímicos. Os resultados mostraram que a ligação de Ca à S. mutans é função da concentração do meio e mostrou ser um fenômeno rápido, onde a máxima saturação é alcançada nos primeiros minutos. Por outro lado, a cinética de liberação mostrou ser um fenômeno mais lento, onde significativa quantidade de íons é encontrada ligada às bactérias mesmo após 60 min de tratamento com solução livre de Ca. Ademais, a liberação parece ser função direta do pH do meio e não influenciada pela quantidade de Ca previamente ligada. A ligação de F às bactérias também mostrou ser um fenômeno rápido, mas não dependente da concentração de Ca ligado às bactérias. A ligação deste último também não foi afetada pela presença de F no meio. De forma geral, os resultados sugerem que a ligação de Ca na superfície bacteriana pode funcionar como um importante reservatório capaz de perdurar por um significativo período de tempo e ser prontamente liberado para o fluido do biofilme durante uma queda de pH. Além disso, a ligação de F às bactérias parece não ser influenciada pela presença de Ca.The study of the retention of mineral ions in dental biofilm and their release to the biofilm fluid is important to understand the role of these reservoirs to interfere with the dental caries process. It is known that fluoride (F) is bound to the biofilm by interaction with calcium (Ca) ions. One type of reservoir formed is Ca-F bridging in bacteria surface and in proteins of the extracellular matrix. When pH drops in dental biofilm after a sugar exposure and a subsaturation state is established, favoring dental demineralization, the ions released from these reservoirs could reduce the potential for mineral loss, but this is unclear in the literature. Furthermore, there is evidence that a Ca pre-rinse increases F retention in biofilm and to evaluate the kinetics of binding and release these ions could be an important strategy to the development of methods that keep them for longer periods in the dental biofilm. Thus, this study aimed to evaluate the kinetics of Ca and F binding and release from bacteria surface as a function of time and pH. Streptococcus mutans IB 1600 was used in all experiments. In vitro studies were conducted to evaluated the kinetics of Ca binding and release using treatments solutions containing 0, 1 or 10 mM Ca. The release capacity also was evaluate after a pH drop. Furthermore, the binding capacity and kinetics of fluoride at 52.6 ?M F (1 ppm F) to bacteria was evaluated. The amount of Ca and F bound to bacteria after equilibrium with treatment solutions was determined in the bacterial pellet after treatment with strong acid, using a colorimetric method and F electrode, respectively. Curves and parameters of binding and release were calculated and treated as biochemical phenomena. Results showed that Ca binding to S. mutans is concentration-dependent and rapid, with maximum saturation achieved in the first minutes. On the other hand, Ca release was shown to be a slower phenomenon, since a significant amount of ions was still bound after 60 min of treatment with Ca-free solution. Moreover, the Ca release seems to be a direct function of media pH and not influenced by the amount of Ca previously bound. F binding to bacteria also shown to be a rapid phenomenon, but independent of Ca concentration in bacteria. Also, Ca binding was not affected by F presence in the treatment solution. In summary, the results suggest that ions bound to bacterial surface could be an important reservoir able to persist for a significant period of time and be released into the biofilm fluid during a pH drop. Furthermore, F binding to bacteria seems not to be influenced by Ca previously bound