S-nitrosation of mTORC1 reduces cancer cell proliferation

A S-nitrosação é uma modificação pós-traducional dinâmica e reversível de proteínas que controla importantes funções celulares através da alteração de resíduos tióis de cisteínas pelo óxido nítrico (NO). Assim como a fosforilação, a S-nitrosação é capaz de alterar a conformação, a atividade e a função de proteínas e contribui em grande parte para a influência ubíqua do NO nas vias de transdução de sinal celulares. Inúmeras evidências apontam para um papel crucial da S-nitrosação não apenas na fisiologia dos organismos, mas também em inúmeras doenças humanas, entre elas o câncer. Entretanto, trata-se de um mecanismo ainda pouco explorado de modulação de proteínas envolvidas com a progressão tumoral, como as presentes na via do mTOR. Assim, o objetivo do trabalho é analisar os mecanismos pelos quais o NO afeta a função do mTOR. A análise da S-nitrosação do mTOR foi realizada através do Biotin Switch Method e demonstra que o doador exógeno de NO, GSNO, aumenta os níveis de mTOR S-nitrosada. Além disso, a GSNO reduz a fosforilação das proteínas mTOR, p70S6K e 4EBP-1 de forma tempo- e dose-dependente. A fosforilação da proteína p70S6K, reduzida pela exposição ao NO, é restaurada pela adição do agente redutor e denitrosante DTT. Entretanto, o pré-tratamento das linhagens celulares PC-3, DU145 e MCF-7 com o inibidor da guanilil ciclase, ODQ, ou com o sequestrador de NO livre, PTIO, não reverte o efeito da GSNO na fosforilação das proteínas mTOR, p70S6K e 4EBP-1, corroborando a hipótese de que o mTORC1 é modulado por S-nitrosação. A viabilidade das linhagens tumorais humanas PC3, DU145, MDA-MB-468, MCF-7, HT-29, CACO-2 e A549 também diminui após exposição aos doadores de NO, sendo observada redução da proliferação e aumento da morte celular. As linhagens PC-3, MCF-7 e MDA-MB-468, que apresentam mutações ativadoras na cascada de sinalização PI3K-mTOR, são mais sensíveis à presença do NO. Assim, a S-nitrosação do mTORC1 é uma importante modificação pós-traducional capaz de modular a atividade quinase da proteína mTOR e reduzir a proliferação de células tumorais humanas, apresentando potenciais implicações terapêuticas.S-Nitrosation is a dynamic and reversible post-translational modification of proteins that controls important cellular functions through the modification of cysteine thiol side chains by nitric oxide (NO). mTOR signaling pathway deregulation is involved in various cancer types and contributes to cancer cell proliferation as well as growth factor independence. The aim of this work was to analyze the mechanisms by which S-nitrosogluthatione (GSNO) affects mTOR function. S-nitrosation of mTOR was assessed by the Biotin Switch Method. GSNO was shown to S-nitrosate mTOR with a consequent time- and dose-dependent decrease in the phosphorylation of mTOR and S6K proteins, which were reversed by the addition of the denitrosating agent DTT. Pre-treatments of cells with the inhibitor of soluble guanylyl cyclase, ODQ, or with the NO scavenger, PTIO, had no effect on the GSNO-mediated decrease in phosphorylation of mTOR and its substrates p70S6K and 4EBP-1. Results also demonstrated that cancer cell line viability decreased after exposure to the NO donors GSNO and S-nitroso-N-acetyl-cysteine (SNAC), altering proliferation and increasing cell death. PC-3, MCF-7 and MDA-MB-468 cell lines, which have mutations in the PI3K-mTOR pathway, showed a greater response to GSNO. Therefore, S-nitrosation is a novel post-translational modification capable of modulating mTOR activity, with possible therapeutic implications