The study of biochemical and pharmacogenetic markers in response to enalapril in hypertensive patients

A hipertensão é um fator de risco bem estabelecido para doenças cardiovasculares. Embora existam muitas classes de drogas disponíveis, os inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina (iECA) são uma das classes mais amplamente utilizadas. O efeito anti-hipertensivo dos iECA envolve a vasodilatação e a melhora da função endotelial através da inibição da ECA, levando a uma diminuição da formação de angiotensina II (ang II) e aumento dos níveis de bradicinina. A diminuição da pressão arterial promovida pelo iECA é explicada, ao menos em parte, pelo aumento da formação de óxido nítrico (NO) proporcionado pela bradicinina e diminuição do estresse oxidativo e vasoconstrição induzidos pela ang II. Apesar de vários estudos com modelos animais e in vitro evidenciarem que o tratamento com iECA promove aumento da biodisponibilidade de NO em nível tecidual, não existe consenso entre os estudos clínicos que buscam associação dos níveis circulantes dos metabólitos estáveis de NO com a resposta anti-hipertensiva a essa classe de drogas. Além disso, evidências crescentes indicam que os efeitos de drogas que aumentam a biodisponibilidade de NO são modulados por polimorfismos no gene da síntase endotelial do óxido nítrico (eNOS) e do receptor tipo 2 de bradicinina (BDKRB2). Assim, os objetivos do nosso estudo foram: 1) Identificar possíveis associações entre o tratamento com enalapril e mudanças em marcadores relevantes relacionados ao estresse oxidativo e a formação de óxido nítrico e 2) investigar se polimorfismos genéticos/haplótipos nos genes da eNOS e do BDKRB2 afetam a resposta anti-hipertensiva ao enalapril. Para atingir nosso primeiro objetivo, dezoito pacientes hipertensos foram tratados com enalapril por 60 dias e dezoito voluntários normotensos foram seguidos pelo mesmo período de tempo. Amostras de sangue venoso foram coletadas antes do início do tratamento e após 30/60 dias de tratamento com enalapril. As concentrações de NOx (nitrito + nitrato) no plasma foram medidas usando reação de Griess. As concentrações de nitrito no plasma e no sangue total foram determinadas por quimioluminescência. Já as concentrações das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e de 8-isoprostano no plasma foram determinadas por método fluorimétrico e ELISA, respectivamente. O tratamento com enalapril diminuiu a pressão arterial nos pacientes hipertensos. No entanto, não encontramos mudanças estatisticamente significativas nas concentrações de NOx plasmático e nitrito medidos no plasma e sangue total nem em marcadores de estresse oxidativo em indivíduos normotensos ou pacientes hipertensos tratados com enalapril. Adicionalmente, para atingirmos o segundo objetivo proposto, nós avaliamos cento e seis pacientes hipertensos tratados com enalapril por 60 dias. A diferença entre a pressão arterial média (PAM) antes e após o tratamento anti-hipertensivo foi definida como ?PAM. Os pacientes foram agrupados como respondedores pobres (RP) ou respondedores bons (RB) quando ?PAM foi menor ou maior que a mediana, respectivamente. O DNA genômico foi extraído a partir do sangue total e amostras foram então genotipadas para os polimorfismos da eNOS através de reação de PCR seguida por eletroforese para o polimorfismo 4b/4a e por PCR em tempo real para os polimorfismos T -786C e G894T. As frequências dos haplótipos da eNOS foram estimadas pelo programa PHASE. Os polimorfismos C-58T e BE1 +9/-9 e os haplótipos do gene BDKRB2 foram determinados por reação de PCR seguida por sequenciamento. Os genótipos TC/CC e o alelo C para o polimorfismo T-786C no gene da eNOS foram mais frequentes entre os RB quando comparado aos RP. Adicionalmente, o genótipo TT para o polimorfismo C-58T no gene do BDKRB2 foi mais frequente em RP quando comparado ao grupo dos RB. Não foram encontradas outras diferenças significativas nos demais genótipos avaliados nem nos haplótipos. Esses achados nos sugerem que o polimorfismo T-786C no gene da eNOS e C-58T no gene do BDKRB2 afetam a resposta anti-hipertensiva ao enalapril.Hypertension is an established risk factor in cardiovascular diseases. Although there are many available drugs, angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) are one of the most widely used drug class. The antihypertensive effects of ACEi involve vasodilation and improved endothelial function resulting from ACE inhibition, which lowers angiotensin II formation and increases bradykinin levels. The effect of blood pressure lowering of ACEi are explained, at least in part, by enhanced bradykinin-dependent nitric oxide (NO) formation and decreased angiotensin II-induced oxidative stress and vasoconstriction. Although previous studies in animal models or in vitro showed that ACEi increase NO bioavailability at tissue levels, there aren't consensus regarding clinical studies involving circulating concentrations of NO metabolites in responsiveness to antihypertensive therapy. Moreover, there is growing evidence indicating that the effects of drugs that improve NO bioavailability are modulated by polymorphisms of endothelial nitric oxide syntase (eNOS) and bradykinin type 2 receptor (BDKRB2) gene. Thus, the objectives of this study were: 1) to identify possible associations between the treatment with enalapril and changes in relevant markers of oxidative stress and NO formation and 2) to investigate if polymorphisms (or haplotypes) of eNOS and BDKRB2 genes affect the antihypertensive response to enalapril. To achieve our first goal, untreated hypertensive patients were treated with enalapril for 60 days and eighteen normotensive healthy controls were followed for the same period. Venous blood samples were collected at baseline and after 30/60 days of treatment with enalapril. Plasma NOx (nitrites+nitrates) concentrations were determined by using the Griess reaction. Plasma nitrite and whole blood nitrite concentrations were determined by using an ozone-based chemiluminescence assay. Plasma thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) and 8- isoprostane concentrations were determined by a fluorimetric method and by ELISA, respectively. The treatment with enalapril decreased blood pressure in hypertensive patients. However, we didn't find significant changes in plasma NOx, nitrite, whole blood nitrite, and in the levels of markers of oxidative stress in both normotensive controls and hypertensive patients treated with enalapril. Moreover, to achieve our second goal, we evaluated one hundred and six hypertensive patients treated with enalapril for 60 days. The difference between the mean arterial pressure (MAP) before and after the antihypertensive treatment was defined as ?MAP. The patients were classified as poor responders (PR) or good responders (GR) when their ?MAP were below or above the median value, respectively. Genomic DNA was extracted from whole blood, and then the genotypes for eNOS were determined by PCR followed by electrophoresis for 4b/4a polymorphism and by real time PCR for T-786C and G894T polymorphisms. The eNOS haplotype frequencies were determined by the programs PHASE. The C-58T and BE1 +9/-9 polymorphisms of BDKRB2 gene and their haplotypes were determined using PCR amplification, followed by DNA sequencing. The TC/CC genotypes and the C allele for the T-786C polymorphism of eNOS gene were more frequent in GR, compared with PR patients. Furthermore, the TT genotype for the C-58T polymorphism of BDKRB2 gene were more frequent in PR when compared with GR. No other significant differences in genotypes or haplotypes were found. These findings suggest to us that both T-786C polymorphism of eNOS gene and C-58T polymorphism of BDKRB2 gene affect the antihypertensive response to enalapril