Structural and functional characterization of hydrocarbon degradation genes from microbial metagenome derived from petroleum reservoirs

A ocorrência de óleos biodegradados nos reservatórios de petróleo, juntamente com o isolamento das primeiras bactérias a partir destes ambientes, forneceu evidências de micro-organismos ativos no subsolo profundo. Os micro-organismos, habitantes comuns de reservatórios de petróleo, desenvolveram estratégias eficazes de biodegradação, baseados em sistemas enzimáticos e vias metabólicas especializadas, de maneira a acessar os hidrocarbonetos como fonte de carbono e energia. No entanto, o conhecimento atual da diversidade microbiana e dos processos metabólicos envolvidos na biodegradação em reservatórios de petróleo ainda é limitado, principalmente devido à dificuldade em recuperar a complexa comunidade microbiana presente em tais ambientes extremos. Essa limitação imposta pelo uso de técnicas de cultivo convencionais pode ser superada através do uso de abordagens independentes de cultivo, como a metagenômica, a qual permite o acesso ao potencial metabólico dos micro-organismos não cultivados. Em trabalho prévio, uma biblioteca metagenômica fosmidial derivada de enriquecimentos aeróbios e anaeróbios de petróleo foi construída e avaliada para a capacidade de crescimento microbiano em hexadecano como fonte de única de carbono. No presente estudo, foi analisada a capacidade de biodegradação de hexadecano e fenantreno pelos clones selecionados dessa biblioteca através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). As análises que se sucederam tiveram como objetivos a identificação e caracterização das sequências metagenômicas responsáveis pela biodegradação de hidrocarbonetos. A estratégia de clonagem aleatória "shotgun" seguida de sequenciamento dos clones foi utilizada para determinar a sequência inteira dos insertos fosmidias que mostraram relevantes capacidades de biodegradação. Cerca de 30 kb de sequência foram montados para o fosmideo 1A (91% de degradação do hexadecano e 5% do fenantreno) e 37 kb para o fosmideo 2B (98% de degradação do hexadecano e 44% do fenantreno), e em cada um foram reconhecidos 23 ORFs e 40 ORFs, respectivamente. As proteínas putativas foram identificadas por comparação das sequências de aminoácidos deduzidas. Várias proteínas envolvidas na degradação aeróbia e anaeróbia de diferentes compostos de hidrocarbonetos foram encontradas. As sequências que codificam estas enzimas não mostraram-se agrupadas em clusters completos de degradação, semelhantes aos encontrados nas bactérias degradadoras de hidrocarbonetos conhecidas. Os fragmentos metagenômicos continham apenas subconjuntos de genes pertencentes a várias vias, mostrando novos arranjos gênicos. Esses resultados reforçam o potencial da abordagem metagenômica para a prospecção e elucidação de novos genes e vias metabólicas, contribuindo para uma visão mais abrangente dos processos de biodegradação que ocorrem nos reservatórios de petróleo.The occurrence of biodegraded oil in petroleum reservoirs, along with the isolation of the first bacteria from such environments, provided evidence for active microorganisms in the deep subsurface. Microorganisms are common inhabitants of petroleum reservoirs and they may have effective biodegrading strategies, based on specialized enzyme systems and metabolic pathways, as a form to access hydrocarbons as carbon and energy sources. However, the current knowledge of the microbial diversity and metabolic pathways involved in hydrocarbon biodegradation in petroleum reservoirs is still limited, mostly due to the difficulty in recovering the complex community present in such extreme environments. This limitation imposed by conventional culturing techniques can be circumvented by the metagenomic approach, which is a culture-independent molecular method that allows the access to the metabolic potential of previously uncultured microorganisms. In a previous work, a metagenomic fosmid library derived from aerobic and anaerobic petroleum enrichments were constructed and screened for the detection of microbial growth on hexadecane as sole carbon source. In this study, the biodegradation abilities on hexadecane and phenanthrene of selected clones were analyzed using Gas Chromatography - Mass Spectroscopy (GC-MS) and subsequent analyses aimed at the identification and characterization of metagenomic sequences responsible for the hydrocarbon biodegradation. The shotgun sequencing approach was used to determine the whole insert sequence of two fosmid clones showing different and relevant biodegradation capacities, FOS1A (91% hexadecane and 5% phenanthrene degradation) and FOS2B (98% hexadecane and 44% phenanthrene degradation). About 30 kb in sequence were assembled for the fosmid 1A and 37 kb for fosmid 2B, and 23 ORFs and 40 ORFs were recognized in each one, respectively. Putative proteins were identified by comparison of deduced aminoacid sequences. Several proteins involved in the degradation of different hydrocarbon compounds by aerobic and anaerobic pathways were found. The sequences coding these enzymes were not grouped together into complete clusters of degradation pathways similar to those already described in known hydrocarbon degrading bacteria. The metagenomic fragments contained only subsets of gene belonging to different pathways, showing novel gene arrangements. The results obtained in this study reinforce the potential of the metagenomic approach for the prospection and elucidation of new genes and pathways, contributing to a broader perspective of the biodegradation processes that take place in petroleum reservoirs