Identification of biological structures by atomic force microscopy

Este trabalho tem como finalidade mostrar a importância dos diferentes modos da Microscopia de Varredura por Ponta de Prova (SPM) numa abordagem complementar para o estudo de dois diferentes sistemas biológicos. O processo de formação de biofilmes da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa (Xf) foi o primeiro sistema abordado neste trabalho. Neste caso nosso objetivo é levantar informações que possam complementar o modelo mais aceito atualmente e corroborar os resultados obtidos anteriormente em nosso grupo. As amostras foram preparadas sobre substratos de silício recoberto com ouro e cultivadas durante tempos de crescimento de 7, 14 e 21 dias. O principal modo utilizado foi a Microscopia de Força Atômica por Kelvin Probe por modulação de amplitude (AM-KPFM) que fornece o potencial de superfície com resolução nanométrica. Imagens por KPFM foram adquiridas simultaneamente com as de topografia e fase obtidas por Microscopia de Força Atômica no modo não-contato (NC-AFM). Os resultados obtidos revelaram um processo de recobrimento gradual das bactérias por um filme de substância polimérica extracelular (EPS), concordando com os modelos propostos na literatura, porém ainda não comprovados. Imagens adquiridas por microscopia óptica (MO) mostram um desenvolvimento mais lento dos biofilmes (BF) em comparação aos resultados de G. S. Lorite para BF sobre substratos de silício obtidos anteriormente em nosso grupo. Isto está de acordo com a preferência das bactérias por superfícies com potenciais mais altos. Um resultado original está na observação de protuberâncias encontradas nas extremidades das bactérias, que mostram sinal elétrico diferenciado do resto da célula. Acreditamos que estas estruturas estão relacionadas ao processo de reprodução, pois aparecem tanto em bactérias isoladas como nas que estão no BF para todos os tempos de crescimento. O segundo sistema estudado foi a formação de estrutura quadrúplex-G de DNA. As amostras de DNA foram preparadas sobre mica e medidas no modo NC-AFM. Embora o DNA seja um sistema muito estudado em AFM, o protocolo de preparação das amostras muda segundo o tipo de estrutura que se queira visualizar. Assim, a maior parte do trabalho neste caso consistiu em desenvolver este protocolo de preparação que permitisse a visualização por AFM das estruturas de interesse. Usando concentrações altas de DNA (5ng/µL) as imagens apresentaram estruturas auto-organizadas que impedem a visualizaçã da estrutura quadrúlex·G. Para concentraçõs menores que 0,5ng/µL conseguimos visualizar moléulas isoladas, mas ainda assim as moléulas nã ficaram num estado relaxado. Um resultado interessante foi encontrado nas imagens de fase de moléulas isoladas (com concentraçã de DNA de 0,1ng/µL) onde se observam diferençs estruturais no interior das moléulas, possivelmente devido àformaçã da estrutura quadrúlex-G. Estas diferençs de fase representam um resultado original e mostram a importâcia da complementaridade dos modos AFM na observaçã de fenôenos biolóicosThe aim of this work is to show the importance of different modes of Scanning Probe Microscopy (SPM) in a complementary approach to the study of two different biological systems. The process of biofilm formation of the phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa (Xf) was the first system discussed in this work. In this case our goal is to gather information that complements the currently most accepted model and corroborates the results obtained previously in our group. The samples were prepared on silicon substrates coated with gold and cultivated during 7, 14 and 21 days. The main results were obtained using Kelvin Probe Atomic Force Microscopy with amplitude modulation (AM-KPFM) which provides the surface potential with a nanometric resolution. Images were acquired by KPFM simultaneously with topography and phase images obtained by Atomic Force Microscopy in non-contact mode (NC-AFM). The results revealed a process of gradual coating of the bacteria by a film of extracellular polymeric substance (EPS), in agreement with the models proposed in the literature, but not yet proven. Images acquired by optical microscopy (OM) show a slower development of the biofilms (BF) compared to the results of G. S. Lorite for BF on silicon substrates obtained previously in our group. This result agrees with the preference of the bacteria for surfaces with large potentials. An original result is the observation of lumps found at the extremities of the bacteria, which show electrical signal different from the rest of the cell. We believe that these structures are related to the reproduction process as they appear both in isolated bacteria and those on BF for all growth times. The second system studied was the formation of G-quadruplex structure of DNA. DNA samples were prepared on mica and measured in the NC-AFM mode. Although DNA is a well studied system in AFM, the sample preparation protocol changes depending on the type of structure to be viewed. Thus, most of the work described here was to develop the preparation protocol that allows the visualization of the structures of interest by AFM. Using high concentrations of DNA (5ng/µL) the images showed self-organized structures that prevent visualization of G-quadruplex structure. For concentrations less than 0.5 ng/mL we got isolated molecules, but still the molecules were not in a relaxed state. An interesting result was found in the phase images of isolated molecules (with DNA concentration of 0.1 ng/mL) where structural differences are observed within the molecules, possibly due to the formation of G-quadruplex structure. These phase differences represent an original result and show the importance of the complementarity of AFM modes in the observation of biological phenomen