Phenotypic and functional characterization of human dendritic cells induced by Paracoccidioides brasiliensis yeast cells

A resposta Th1 com a ativação eficiente de macrófagos constituiu o principal mecanismo de defesa na infecção causada pelo Paracoccidioides brasiliensis. Componentes do sistema imune inato que induzem a polarização a resposta adaptativa como as células dendríticas (DCs) e seus produtos foram pouco explorados, principalmente na doença humana. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente e funcionalmente DCs obtidas a partir de monócitos do sangue periférico (MSP) de indivíduos saudáveis (C), pacientes com a forma adulta (FA) e juvenil (FJ) da paracoccidioidomicose (PCM), estimuladas in vitro por células leveduriformes do fungo P. brasiliensis das cepas Pb18 (alta virulência) e Pb265 (baixa virulência). Em uma segunda etapa pretendeu-se verificar se estas DCs eram capazes de ativar linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos. Os MSP foram cultivados na presença de IL-4 e GM-CSF por 7 dias e posteriormente submetidos à estimulação por células leveduriformes do fungo (Pb18 ou Pb265) ou CD40L (controle positivo) ou somente meio (SE) por 18 horas. DCs derivadas de monócitos do sangue periférico dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) se diferenciam em DCs maduras na presença de células leveduriformes do fungo. Nos pacientes com as FA e FJ as células leveduriformes Pb18 e Pb265 induzem maturação semelhante nas DCs que passam a expressar características morfológicas e fenótipo de células maduras com aumento da expressão dos marcadores de maturação (CD83 e CCR7), das moléculas de coestimulação (CD80/B7-1 e CD86/B7-2), das moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (HLA-I e HLA-II), dos receptores envolvidos no reconhecimento de antígenos (TLR2, TLR4 e dectina-1) e diminuição da expressão do CD1a e CD209. No grupo C foram observadas as mesmas características de fenótipo acima mencionadas, mas de forma mais evidente em DCs que foram estimuladas com as células leveduriformes da cepa Pb265, quando comparada a Pb18. DCs estimuladas com CD40L mostraram potencial máximo de expressão dos marcadores de superfície. Constatou-se também em DCs do grupo controle uma diminuição da capacidade fagocítica, após 18h de contato com as células leveduriformes do fungo, comprovando o processo de maturação, que foi mais efetivo na presença de Pb265. A análise da expressão gênica demonstrou que ambas as células leveduriformes do fungo induziram a expressão de TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 e TGF- . A estimulação das DCs com as células leveduriformes da cepa Pb265 induziu aumento da expressão de IL-6 (C, FA, FJ). Em relação à IL-10 as células leveduriformes Pb265 induziram maior expressão somente nos pacientes (FA e FJ). Na segunda etapa do estudo verificou-se que DCs fenotipicamente competentes foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos de forma mais acentuada quando eram provenientes de pacientes. Nestes grupos (FA e FJ) também foi constatada uma diminuição da frequência de linfócito T CD4+/CD8+/CD45RA+ e um aumento da frequência células CD4+/CD8+/CD45RO+ e CD4+/CD8+/CD69+. Inesperadamente, os resultados também mostraram que DCs dos 3 grupos estudados, que foram estimuladas com células leveduriformes do fungo, induziram a proliferação de linfócitos T CD3+CD4+CD25+Foxp3+, em relação às DCs que não receberam estímulos (SE). DCs de pacientes que foram estimuladas por ambas as células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IL-2, IL-17, IL- 10 e IFN- por LT/CD3+CD8(neg), quando comparada com DCs do grupo C. Por outro lado, DCs dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) que foram estimuladas células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IFN- por LT/CD3+CD8+. Em conjunto os resultados do nosso estudo mostraram que a estimulação com células leveduriformes do fungo induz uma população heterogênea de DCs, capazes de dar origem a uma resposta linfocitária mista com proliferação de linfócito Th1 (produtoras de IFN-?), Th17 (produtoras de IL-17) e células com fenótipo regulatório Foxp3+ (produtoras de IL-10)A Th1 response with an efficient activation of macrophages is the main mechanism of defense in Paracoccidioides brasiliensis infection. Components of the innate immune system that induce the polarization of the adaptive response such as dendritic cells (DCs) and their products have been little explored, particularly in human disease. The aim of this study was to phenotypically and functionally characterize DCs obtained from peripheral blood monocytes (PBM) of healthy individuals (C), patients with the adult form (AF) and juvenile form (JF) of paracoccidioidomycosis (PCM), induced in vitro by P. brasiliensis yeasts cells of Pb18 (high virulence) and Pb265 (low virulence) strains. In a second step we sought to determine whether these DCs were capable of activating autologous CD4/CD8 T cells. PBM were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF for 7 days and then stimulated by yeasts cells (Pb18 or Pb265) or CD40L (positive control) or medium only (WE), for 18 hours. PBM of the 3 groups (C, AF, JF) acquired the capacity to differentiate into DCs in the presence of P. brasiliensis yeasts cells. In patients with FA and FJ yeast cells induced maturation of DCs with increased expression of maturation markers (CD83 and CCR7), co-stimulatory molecules(CD80/B7-1 and CD86/B7-2), antigen presentation molecules (HLA-I and HLA-II), receptors involved in antigen recognition (TLR2, TLR4 and dectin-1) and decreased expression of CD1a and CD209. DCs from group C showed the same phenotypic characteristics, more evident in DCs that were stimulated with Pb265 when compared to Pb18. DCs stimulated with CD40L showed maximum expression of surface markers. A decrease in phagocytic capacity was detected in DCs of the control group after stimulation with yeast cells, demonstrating the maturation process, which was more effective in the presence of Pb265. The gene expression analysis showed that both strains of yeasts cells induced expression of TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 and TGF- mRNA. Stimulation of DCs with Pb265 induced increased expression of IL-6 in all groups. Pb265 also induced a higher expression of IL-10 mRNA only in patients (AF and JF). Our study also showed that phenotypically competent DCs were able to stimulate the proliferation of autologous CD4+/CD8+ cells, mainly in patients. In these groups (FA and FJ) it was also observed a reduction in the frequency of CD4+/CD8+/CD45RA+ and na increased frequency of CD4+/CD8+/CD45RO+ and CD4+/CD8+/CD69+. Unexpectedly, the results also showed that DCs stimulated with the yeast cells induced proliferation of T lymphocytes CD3+CD4+CD25+Foxp3+, compared to DCs that received no stimulation. DCs from patients stimulated by both strains of yeast cells induced a higherr production of IL-2, IL-17, IL-10 e IFN- by LT/CD3+CD8(neg) compared with DCs from group C. Moreover, DCs from the 3 groups also induced a stronger IFN-? production by CD3+/CD8+T cells. Altogether the results showed that stimulation with P. brasiliensis yeast cells induces a heterogeneous population of DCs, capable of giving rise to a mixed lymphocyte response with proliferation of Th1, Th17, and Foxp3+ cell