Standardization of Leishmania amazonensis expressing the Green Fluorescent Protein assays

A utilização da Leishmania-GFP tem facilitado o monitoramento de ensaios in vitro e in vivo de infecção para avaliação de fármacos leishmanicidas. A vantagem de usar a Leishmania-GFP como uma ferramenta de quantificação da infecção sobre os métodos tradicionais de fixação e coloração de ensaio in vitro é que consiste em método rápido, de análise direta da amostra sem uma pré-preparação. No entanto, a expressão do gene GFP é heterogênea nas populações de parasitas transfectados e no hospedeiro o plasmídio é perdido na ausência de pressão seletiva ao marcador de resistência resultando em perda da intensidade de fluorescência. Os métodos de seleção dos transfectados são destinados aos promastigotas e não há relatos de seleção de amastigotas de Leishmania-GFP. Em nossos ensaios, a seleção in vitro com o antibiótico geneticina das formas promastigotas-GFP foi bem sucedida, atingindo 90% de parasitas fluorescentes. Na seleção in vivo das formas amastigotas presentes na lesão de camundongos infectados com L. amazonensis-GFP foi observado tanto redução como aumento em relação ao tamanho da lesão e da carga parasitária de camundongos infectados, dependendo do protocolo utilizado. Contudo observamos um aumento da intensidade de fluorescência dos amastigotas retirados da lesão de camundongos tratados com geneticina comparado aos não tratados, bem como um aumento da porcentagem de parasitas fluorescentes. A L. amazonensis-GFP foi utilizada com sucesso para testes com fármacos, usando como controles miltefosina e glucantime tanto em ensaios com culturas de promastigota e como em ensaios de infecção com macrófagos. A diminuição da intensidade de fluorescência foi dosedependente para miltefosina e glucantime. Nós também avaliamos se durante o momento de adesão dos promastigotas em macrófagos peritoneais, o microambiente hipóxico confere interferência neste processo. Na análise dos resultados verificamos que não houve diferença na porcentagem de macrófagos com promastigotas aderidos cultivados em hipóxia 6% de oxigênio comparado a normóxia 21% de oxigênio, mas houve uma diminuição de adesão na condição hipóxia 1% de oxigênio assim como na intensidade de fluorescência dos promastigotas. Concluímos que há uma boa manutenção da fluorescência dos parasitas, usando ensaios de seleção in vitro das formas promastigotas-GFP. Isto torna a L. amazonensis-GFP totalmente viável para o “screening” de fármacos. As formas amastigotas-GFP parecem ser menos sensíveis a geneticina que as formas promastigotas-GFP. Sendo assim, as formas promastigotas- GFP são melhores para o processo de seleção.Leishmania-GFP has facilitated the monitoring of in vitro and in vivo assessment of infection to antileishmanial drugs. The advantage Leishmania-GFP as a tool for quantification of infection over traditional methods of fixation and staining is that it consists of fast and direct analysis without sample pre-preparation. However the expression of the GFP gene is heterogeneous in populations of transfected parasites and in the host, plasmid is lost in the absence of selective pressure for resistance marker resulting in low of fluorescence intensity. The methods of selection are used to promastigotes and there are no reports using amastigotes. In our tests, in vitro selection with the antibiotic geneticin, GFP-promastigotes, reaching a 90% of fluorescent parasites. In vivo selection of amastigotes from lesions of mice infected with L. amazonensis-GFP was observed as well as reduction in the lesion size and parasite load. However we observed an increase of fluorescence intensity in amastigotes from geneticin-treated mice compared to amastigotes from untreated mice as well as an increase of fluorescent parasites. L. amazonensis-GFP was successfully assayed for drug screening of using, miltefosine and glucantime, tested with promastigote and infected macrophages. The decrease of fluorescence intensity was miltefosine and glucantime dose-dependent concentration. We also evaluated adhesion of promastigotes to macrophages; hypoxic microenvironment (1% O2) confers interference in this process. In the analysis of the results we found no difference in the percentage of macrophages with attached promastigotes cultured in 6% oxygen hypoxia compared to normoxia 21% oxygen, but there was a decrease of adhesion in hypoxia condition 1% oxygen as well as in fluorescence intensity of promastigotes. We conclude that there is a good maintenance of parasites fluorescence, Which makes L. amazonensis-GFP fully viable for drug screening. The GFP-amastigote appears to be less sensitive to geneticin that GFP-promastigotes. Thus the GFP-promastigotes are better for the selection process