Studies of structure and function of Lys49 PLA2 Lys49 from Bothrops jararacussu and evaluating the effect of synthetic coumarins on its structure and biological activity

Mionecrose e edema são dois dos efeitos de fosfolipases A2 secretórias (sPLA2s) de serpents do genero Bothrops, BjVIII é uma nova Lys49 PLA2 miotóxica isolada do veneno de Bothrops jararacussu que exibe efeitos atípicos na agregação plaquetária humana e aumenta a secreção de insulina. Nestes estudos, demonstramos que BjVIII aumenta a liberação de insulina das células beta do pâncreas e induz a agregação plaquetária. Utilizando degradação de Edman e seqüenciamento de aminoácidos de novo por massa, nós determinamos a seqüência primária completa de BjVIII. Esta análise revelou uma mudança do aminoácido G35K na BjVIII, que difere da seqüência de BthTX-I, PrTX-I e PrTX-II e podem estar relacionados com as diferenças observadas na atividade biológica entre BjVIII e outras Lys49 sPLA2. Estes resultados indicam que além da região C-terminal e B-wing de PLA2, o laço de ligação do cálcio na BjVIII deve ser considerada uma importante região envolvida nos efeitos farmacológicos das isoformas Lys49 sPLA2 do gênero Bothrops. Para entender melhor o modo de ação da BjVIII, estudos cristalográficos foram iniciados. Duas formas de cristais foram obtidos, ambos contendo duas moléculas na unidade assimétrica (ASU). Dados de difração de radiação síncrotron foram coletados a 2,0 °A e 1,9 °A de resolução para os cristais que pertencem ao grupo espacial P212121 (a = 48:4 ° A, b = 65:3 ° A, c = 84:3 ° A) e grupo espacial P3121 (a = b = 55:7 º A, c = 127:9 ° A), respectivamente. Nós apresentamos uma caracterização cristalográfica detalhada de BjVIII. A estrutura foi resolvida em dois grupos de espaço diferentes, onde uma densidade de elétrons inesperada foi supostamente modelada no sítio ativo como uma molécula de ácido lisofosfatidico ao qual foi atribuído o efeito atípico de agregação plaquetária. Além disso, os estudos de bioinformática e comparações moleculares com outras PLA2s mostraram a conservação evolutiva dos mecanismos catalíticos e possibilitou a identificação do mesmo sitio miotóxico recentemente propostos para Lys49-PLA2s. Estrutura cristalográfica de BjVIII e análises do modelo realizadas em nossos estudos têm contribuído para uma melhor compreensão da ação farmacológica de fosfolipases A2. As cumarinas, são compostos químicos encontrados em muitas plantas e sintetizados em laboratórios, tem valor clínico, como precursor de vários fármacos anticoagulantes e antiinflamatórios. Nós caracterizamos os efeitos de duas cumarinas sintéticas, etil 2-oxo-2Hcromeno- 3-carboxilato (EHCC) e ácido 7-hidroxi-2-oxo-2H-cromeno-3-carboxílico (HHCC), sobre a estrutura, e as propriedades biológica e farmacológicas de BjVIII. Os resultados de espectroscopia de fluorescência intrínseca e estudos de dicroísmo circular indicaram que ambos os compostos induzem uma desestruturação parcial da proteína. A análise de aminoácidos revelou que o tratamento com EHCC (BjVIII-EHCC) e HHCC (BjVIII- HHCC) induzem a modificação de aminoácidos da BjVIII. Além disso, observamos uma redução do edema, mionecrose, agregação plaquetária, estimulação da secreção de insulina e atividade antibacteriana induzida por BjVIII após o tratamento com essas cumarinas. Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que EHCC e HHCC induzem uma modificação estrutural irreversível na BjVIII que leva a uma diminuição nas atividades farmacológicas e biológicas induzidas por BjVIII nativa.Myonecrosis and edema are two of the effects of the secretory phospholipases A2 (sPLA2s) of Bothrops jararacussu snake venom, BjVIII is a new myotoxic Lys49-PLA2 isolated from Bothrops jararacussu venom that exhibits atypical effects on human platelet aggregation and increases insulin secretion. In these studies, we demonstrate BjVIII also enhances insulin release from pancreatic beta cells and induces platelet aggregation. Using both Edman degradation and de novo amino acid sequencing by mass, we determined the complete primary sequence of BjVIII. This analysis showed a G35K amino acid change in BjVIII, which differs from the sequences of BthTx-I, PrTx-I, and Prtx-II and may relate to the observed differences in biological activities among BjVIII and other Lys49 sPLA2. These results indicate that besides the C-terminal region and B-wing of PLA2, the calcium binding loop in BjVIII should be considered an important region involved in the pharmacological effects of Lys49 sPLA2 isoforms from the Bothrops genus. To better understand the mode of action of BjVIII, crystallographic studies were initiated. Two crystal forms were obtained, both containing two molecules in the asymmetric unit (ASU). Synchrotron radiation diffraction data were collected to 2.0 °A resolution and 1.9 °A resolution for crystals belonging to the space group P212121 (a = 48:4 ° A, b = 65:3 ° A, c = 84:3 ° A) and space group P3121 (a = b = 55:7 ° A, c = 127:9 ° A), respectively. We present a detailed crystallographic characterization of BjVIII. Structure was solved in two different space groups where an unexpected electron density in the active site was putatively modeled as a lysophosphatidic acid molecule to which has been attributed the atypical platelet aggregation effect. In addition, bioinformatics studies and molecular comparisons with other PLA2s have shown the evolutionary conservation of the catalytic machinery and enabled the identification of the same myotoxic site recently proposed for Lys49-PLA2S. BjVIII crystallographic structures and model analyses performed in our studies have contributed to a better understanding of the pharmacological action of phospholipases A2. Coumarin, a chemical compound found in many plants and synthesized in chemical laboratories, has clinical value as the precursor for several experimental anticoagulants and anti-inflammatory drugs. We characterized the effects of two synthetic coumarins, ethyl 2-oxo- 2H-chromene-3-carboxylate (EHCC) and 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid (HHCC), on the structural, biological, and pharmacological properties of BjVIII. The spectroscopic results from intrinsic fluorescence and circular dichroism studies indicated that both compounds induced partial protein unfolding. Amino acid analysis revealed that treatment with EHCC (BjVIII-EHCC) and HHCC (BjVIII-HHCC) induced amino acid modification of BjVIII. Furthermore, we observed a reduction of BjVIII-induced edema, myonecrosis, platelet aggregation, stimulation of insulin secretion, and antibacterial activity following treatment with these coumarins. Taken together, our results indicate that EHCC and HHCC induce an irreversible structural modification in the folding that leads to a decrease in pharmacological and biological activities induced by native BjVIII