Fetal RHD genotyping by analysis of maternal plasma in a population from Brazil

A análise de plasma materno para a determinação do genótipo RHD fetal é uma importante ferramenta no acompanhamento de gestantes RhD-negativo, especialmente em pacientes aloimunizadas. Este trabalho verificou a acurácia da genotipagem RHD fetal pela análise do plasma materno em uma população do Brasil. Foram analisadas 88 gestantes RhD-negativo entre 11 e 39 semanas de gestação, com idade mediana de 28 anos. Treze (14,78%) pacientes encontravam-se aloimunizadas com anti-D. Foram utilizados primers e sondas para detecção do gene RHD (exons 4, 5 e 10) por PCR em tempo real. Como controle interno, utilizou-se um conjunto de primers e sondas para identificar o genes SRY e CCR5. Sangue periférico ou sangue de cordão umbilical dos respectivos neonatos foram coletados durante o parto para a realização da fenotipagem RhD. A genotipagem RHD convencional foi realizada em todas as 88 amostras de DNA materno. Oitenta e três (94,32%) gestantes apresentaram a deleção do gene RHD e em 5 (5,68%) amostras foram identificadas variantes do gene RHD (3 RHD e 2 DFR). A genotipagem RHD convencional foi também realizada em 17 amostras de DNA paternas. Quinze amostras (88,24%) foram genotipadas como RHD+ (5 RHD+/RHD+ e 10 RHD+/RHD-) e 2 (11,76%), como RHD-. Cinqüenta e oito (65,91%) fetos foram genotipados como RHD+. Vinte e sete (30,68%) amostras apresentaram ausência completa do gene RHD e três fetos apresentaram amplificação apenas para o exon 10, demonstrando a presença de uma possível variante RHD ou RHD-CE-Ds. Todos os resultados da genotipagem RHD fetal foram concordantes com a fenotipagem neonatal incluindo os 3 fetos com a variante RHD, fenotipados como RhD-. Nossos resultados indicam que a genotipagem RHD fetal através da análise do plasma materno amplificando 3 regiões do gene RHD (exons 4, 5 e 10) é adequada para a aplicação clínica. Este protocolo pode-se tornar prática em um futuro próximoMaternal plasma analysis for determination of the fetal RHD status is an important tool for the management of RhD-negative pregnant, specially alloimunized women. We assessed the accuracy of fetal RHD genotyping by analysis of maternal plasma in a multi-ethnic population. We analyzed plasma samples from 88 RhD-negative pregnant women between 11 and 39 weeks of gestation, median age of 28 years old to determine the fetal RHD genotype. This population was from Southeastern Brazil with high mixed ethnic background. Thirteen patients (14,78%) had anti-D alloantibody. We used TaqMan primers and probes to detect exons 4, 5 and 10 of RHD, by real-time PCR. As internal controls, we used primers/probes sets to SRY and CCR5. Peripheral or umbilical cord bloods from respective neonates were collected during delivery and hemagglutination was performed. Conventional RHD genotyping was realized in all pregnant. Eighty-three patients had a deletion of RHD gene and five samples were identified RHD variants (3 RHD and 2 DFR). The conventional RHD genotyping was also performed on 17 DNA samples from fathers. Fifteen samples were genotyped as RHD+ (5 RHD+/RHD+ and 10 RHD+/RHD-) and 2 RHD-negative. Fifty-eight (65,91%) fetuses were genotyped as RHD+. Twenty-seven (30,68%) samples showed completely absence of RHD and three fetuses showed amplification only for the exon 10, demonstrating the presence of a possible variant (RHD or RHD-CE-Ds). All fetal RHD results agreed with the neonatal typing including the 3 fetuses with RHD variant, phenotyped as RhD-negative. Thus, the accuracy of the fetal RHD genotyping in this population was 100%. The earliest pregnancy in which fetal RHD was detected was 11 weeks. Our findings indicate that the accuracy of fetal RHD genotyping from maternal plasma using 3 regions (exons 4, 5 and 10) can be sufficient for clinical application in a multi-ethnic population. This knowledge helped us on the development of a feasible protocol for fetal RHD genotyping on DNA from maternal plasma in our population and should become practice in the near futur