Bioprospection of genes involved in the synthesis of biosurfactants from braziliam petroleum reservoirs microbial communities

Bioemulsificantes ou biossurfactantes são compostos sintetizados por micro-organismos que aumentam a biodisponibilidade de hidrocarbonetos, promovendo a estabilização de substâncias com diferentes polaridades, como por exemplo, emulsões água-óleo existentes nos reservatórios de petróleo. As amostras utilizadas neste trabalho foram coletadas na Bacia Potiguar (RN), e empregadas como inóculo para a realização de enriquecimentos anaeróbios e aeróbios da microbiota do petróleo. A amostra de óleo selecionada (GMR 75) foi obtida a partir de um poço com nível de biodegradação moderado. Após o período de incubação dos enriquecimentos, foi realizada a extração de DNA dos mesmos e a construção das bibliotecas de fosmídios, utilizando-se kit de clonagem comercial. A avaliação da produção de emulsificantes pelos clones fosmidias provenientes das bibliotecas metagenômicas foi realizada através de dois tipos de ensaios de triagem, um teste baseado em atividade biológica e outro em similaridade de sequência. O teste funcional, denominado “colapso da gota”, apresenta caráter qualitativo e foi utilizado para a triagem preliminar de 2.880 clones, gerando 2.104 resultados positivos. Para o teste baseado em seqüência, os clones que se mostraram positivos no teste funcional foram avaliados através de reações de PCR utilizando primers homólogos a regiões conservadas de genes para a síntese de biossurfactantes. Entretanto, nenhum sinal positivo de amplificação foi observado com os primers utilizados. Ensaios de tensiometria, utilizando meio mineral e hexadecano como única fonte de carbono e energia, foram realizados para a confirmação da produção dos emulsificantes pelos clones. Nove clones capazes de reduzir a tensão interfacial de 45 mNm para 30 mN/m foram selecionados e submetidos aos ensaios de emulsificação utilizando petróleo, óleo diesel e hexadecano. Os resultados demonstraram a formação de emulsão, principalmente em óleo diesel, sugerindo poder emulsificante sobre este composto. As análises colorimétricas dos biossurfactantes produzidos pelos nove clones revelaram proporções similares de carboidratos, proteínas e ácidos urônicos, não permitindo resultados conclusivos sobre a composição destes compostos.Bioemulsifiers or biosurfactants are compounds produced by microorganisms which enhance the bioavailability of hydrophobic substances promoting the stabilization of substances with different polarities, like oil-in-water emulsion occurring in petroleum reservoirs. The samples used in this work were collected in the Potiguar Basin (RN, Brazil), and employed as inoculum for aerobic and anaerobic enrichments of the petroleum microbiota. The selected oil sample (GMR 75) was obtained from a reservoir presenting a moderate biodegradation level. After the incubation period of the microbial enrichments, total DNA was extracted and used for the assembly of the metagenomic libraries by using a comercial kit. The evaluation of the potential for emulsifier production by the fosmid clones derived from the metagenomic libraries was performed by means of two screening assays, one based on biological activity and another based on sequence similarity. The functional assay, named “drop collapse”, has a qualitative character and was used for the preliminary screening of 2,880 clones, yielding 2,104 positive results. For the sequence-based assay, clones shown to be positive in the functional assay were evaluated through PCR reactions using primers homologous to conserved regions of genes for biosurfactant synthesis. However, no positive amplification signal was observed with the primers used. Tensitometric assays, using mineral medium and hexadecane as sole carbon and energy source, were performed to confirm the production of the biosurfactants by the clones. Nine clones able to reduce the interfacial tension from 45 mNm to 30 mN/m were selected and subsequently submitted to emulsification assays using petroleum, diesel oil and hexadecane. Results demonstrated the formation of an emulsion, mainly in diesel oil, suggesting the emulsifier power of the biosurfactants over this substance. Colorimetric analyses of the biosurfactants produced by the clones revealed similar proportion of carbohydrates, proteins and uronic acids, not allowing conclusive characterization of their composition