Activity of soybean extracts enriched in aglycone isoflavones on the synthesis and degradation of nitric oxide and on the control of breast cancer cell proliferation in vitro

Embora as isoflavonas de soja naturalmente se acumulem nas formas glico- emalonil-conjugadas, os efeitos benéficos dos alimentos a base de soja para a saúde humana tem sido creditados às formas agliconas. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia para produção de extratos de soja enriquecidos em isoflavonas agliconas e avaliar suas atividades na síntese e na degradação de óxido nítrico (NO) e na proliferação de células de adenocarcinoma de mama (MCF-7) cultivadas in vitro. O doador de óxido nítrico (NO), nitroprussiato de sódio (SNP), foi utilizado como agente indutor para o acúmulo de isoflavonas em sementes de soja, que foram identificadas e quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas. O tratamento com SNP aumentou a síntese das isoflavonas agliconas de forma dosedependente. A produção relativa de formas agliconas foi de aproximadamente 75% nos exsudatos (solução indutora), em comparação com a extração feita apenas a partir somente dos tecidos (34%). Após tratamento com SNP, o exsudato do eixo embrionário acumulou a maior quantidade de isoflavonas livres (1,61 µg/mg) em relação ao cotilédone (1,1 µg/mg), enquanto que nos controles a produção total de isoflavonas foi de 0,3 µg/mg, sendo 95% nas formas conjugadas. Os extratos (350 µg) do eixo embrionário ou cotilédone enriquecido em agliconas, mas não os controles, estimularam a redução ácida do nitrito (determinada com eletrodo específico) levando à produção de 1,4 e 0,9 ηmol de NO em pH 2,0, valores que foram 8 vezes e 5,1 vezes maiores quando comparados à redução apenas na presença de 50 µM de nitrito. A atividade redutora de nitrito foi diminuída com a elevação do pH e estes resultados foram validados através da detecção de NO por quimiluminescência. As principais isoflavonas, livres ou conjugadas, identificadas nos extratos não estimularam a redução ácida do nitrito. Entretanto, foi observado que o tratamento com SNP também provocou o acúmulo de outros fenólicos, como os ácidos gálico, caféico e p-coumárico, que estimularam a redução ácida do nitrito. Em pH neutro os extratos apresentaram atividade sequestrante de NO sendo o de embrião novamente o mais ativo (0,85 ηmol de NO degradado/min), quando comparado com o cotilédone (0,24 ηmol/min) e com a degradação espontânea do controle (0,1 ηmol/min). Os extratos do eixo embrionário e do cotilédone apresentaram efeito bifásico dose-dependente na viabilidade e proliferação de células MCF-7. Nas doses menores (250-500 µg/mL) os extratos promoveram (10-25%) e em concentrações mais elevadas (750-1000 µg/mL) inibiram (15%) a proliferação celular. Na concentração de 500 µg/mL, o efeito proliferativo dos extratos foi revertido por nitrito (100 µM) em 34-36%. As doses mais elevadas dos extratos também estimularam a emissão de NO (detectado com um indicador fluorescente). O efeito bifásico foi atribuído à ação das isoflavonas agliconas em ativar os receptores estrogênicos e estimular a produção de NO, o que foi potencializado pelo nitrito. O conjunto dos resultados sugere que os extratos de soja enriquecidos em compostos bioativos interferem no metabolismo do NO e na proliferação de células de adenocarcinoma de mama.Although soybean isoflavones naturally accumulate in their glyco- and malonylconjugated forms, the beneficial effects that soybean containing foods have on human health have been credited to their aglycones. This study aimed to develop a methodology for producing soybean extracts enriched with isoflavones aglycones and evaluate their activities in the synthesis and degradation of nitric oxide (NO) and proliferation of breast carcinoma cells (MCF-7) cultured in vitro. The nitric oxide (NO) donor, sodium nitroprusside (SNP), was used as a promoter for the accumulation of isoflavones in soybean seeds, which were identified and quantified by high performance liquid chromatography and mass spectrometry. SNP treatment increased the synthesis of the aglycone isoflavones in a dose-dependent manner. The relative production of aglycone forms was approximately 75% in the exudates (promoter solution), compared to the extraction made from only the tissues (34%). After treatment with SNP, exudate from the embrionary axis accumulated the largest amount of free isoflavones (1.61 µg/mg) compared to cotyledon (1.1 µg/mg), whereas in controls the total production of isoflavones was 0.3 µg/mg, with 95 % in conjugated forms. The extracts (350 µg) of embrionary axis or cotyledon enriched in aglycones, but not the controls, stimulated the acid reduction of nitrite (measured with specific electrode) leading to production of 1.4 and 0.9 ηmol of NO at pH 2, 0, values that were 8 times and 5.1 times higher when compared to the reduction only in the presence of 50 µM nitrite. The nitrite reduction activity was decreased with increasing pH and these results were validated by detection of NO by chemiluminescence. The main isoflavones, free or conjugated, identified in the extracts did not stimulate the acid reduction of nitrite. However, we observed that treatment with SNP also caused the accumulation of other phenolic compounds such as gallic, caffeic and p-coumaric acids, which stimulated the acid reduction of nitrite. At neutral pH extracts showed scavenging activity of NO and the embryo again was the most active (0.85 ηmol NO degraded/min) when compared to the cotyledon (0.24 ηmol/min) and to the spontaneous degradation of the control (0.1 ηmol/min). The embryo and cotyledon extracts showed dose-dependent biphasic effects on viability and proliferation of MCF-7 cells. At lower doses (250-500 µg/mL) extracts promoted (10-25%) and at higher concentrations (750-1000 µg/mL) inhibited (15%) cell proliferation. At 500 µg/mL, the proliferative effect of the extracts was reversed by nitrite (100 µM) in 34-36%. The higher doses of the extracts also stimulated emission of NO (detected with a fluorescent indicator). The biphasic effect was attributed to the action of isoflavone aglycones in activating estrogen receptors and stimulating the production of nitric oxide, which was increased by nitrite. Overall, the results suggested that soybean extracts enriched in bioactive compounds interfere with the metabolism of NO and the proliferation of breast adenocarcinoma cells