Effect of antenatal retinoic treatment on the expression of VEGF and its recptors VEGFR1 and VEGFR2 in the animal model of nitrofen-induced congenital diaphragmatic hernia

A hérnia diafragmática congênita (HDC) é uma doença grave com alta mortalidade devido à hipoplasia e hipertensão pulmonar. A via do ácido retinóico tem sido implicada na patogênese da HDC e pode ser uma alternativa de intervenção na promoção da alveolarização e vascularização pulmonar. O fator de crescimento vascular do endotélio (VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor) e seus receptores VEGFR1 e VEGFR2 têm importante função no crescimento e na vascularização pulmonar, e, possivelmente, na patogênese da HDC. No entanto, não se conhece como o tratamento pré-natal com ácido retinóico pode afetar a vascularização pulmonar e seus fatores de crescimento. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito do tratamento pré-natal com ácido retinóico na vascularização pulmonar e na expressão pulmonar de VEGF e seus receptores VEGFR1 e VEGFR2 em fetos de rato com HDC induzida pelo nitrofen (2,4-dicloro-4'nitrodifenil éter). Fetos de ratas Sprague-Dawley prenhes foram divididos em oito grupos: 1) controle externo, 2) placebo óleo nitrofen; 3) placebo óleo ácido retinóico, 4) tratados com ácido retinóico, 5) expostos ao nitrofen sem HDC, 6) expostos ao nitrofen com HDC, 7) expostos ao nitrofen sem HDC e tratados com ácido retinóico, 8) expostos ao nitrofen com HDC e tratados com ácido retinóico. Nitrofen foi administrado por via oral (gavagem) com 9,5 dias de gestação. Ácido retinóico foi administrado por via intraperitoneal com 18,5, 19,5 e 20,5 dias de gestação na dose de 5 mg/kg/dia, a coleta fetal foi realizada com 21,5 dias (termo=22 dias). Cada grupo fetal foi composto por 25 fetos. As variáveis morfológicas estudadas foram: peso corporal (PC), peso pulmonar total (PPT), peso do pulmão esquerdo (PPE) e a relação peso pulmonar total / peso corporal (PPT/PC). A morfologia pulmonar foi estudada pela mensuração da média linear de interceptação (MLI) e seus componentes diâmetro interno dos espaços aéreos (DEA) e a relação de comprimento de transecção do parênquima / espaço aéreo (MCTP). A morfologia vascular foi estudada pela mensuração do diâmetro externo (DE), diâmetro interno (DI) e espessura proporcional da camada muscular média (ECM) de arteríolas pulmonares de resistência. A expressão de VEGF e dos receptores VEGFR1 e VEGFR2 foi analisada por meio de imunoistoquímica e western blotting. Os dados morfológicos e morfométricos foram analisados pelo teste ANOVA com pós-teste de Tukey-Kramer, a avaliação semiquantitativa da imunoistoquímica foi analisada pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn, sendo considerados significativos valores de p<0,05 para ambos os testes. A freqüência de HDC observada entre os fetos expostos ao nitrofen foi de 40%. As variáveis morfológicas apresentaram diminuição significativa nos grupos expostos ao nitrofen, especialmente nos fetos com HDC (p<0,05). O tratamento com ácido retinóico não alterou as variáveis morfométricas pulmonares. Fetos com HDC apresentaram aumento da ECM, enquanto o tratamento com ácido retinóico reduziu a ECM nos fetos com HDC (p<0.001). A presença de HDC levou à diminuição da expressão de VEGF, VEGFR1 e VEGFR2, enquanto o tratamento com ácido retinóico recuperou a expressão de VEGF e VEGFR1. A alteração sinalização da via do VEGF na HDC pode estar associada à patogênese da hipoplasia e da hipertensão pulmonar. O tratamento pré-natal com ácido retinóico pode fornecer vias para tratamento da hipertensão pulmonar na HDC por meio da redução da ECM das arteríolas pulmonares e recuperação do VEGF e seus receptoresCongenital diaphragmatic hernia (CDH) is a life-threatening disease with high mortality due to the pulmonary hypertension and hypoplasia. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors VEGFR1 and VEGFR2 play a major role in lung vascularization, growth, and possibly in the pathogenesis of CDH. However it is not know how prenatal treatment with retinoic acid can affect lung vascularization by acting on the VEGF signaling. The purpose of this study was to analyze the effect of antenatal retinoic acid treatment on the expression of pulmonary VEGF and its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 in rat fetuses with CDH induced by nitrofen. Fetuses from pregnant Sprague-Dawley rats (term=22 days) were divided in eight groups: 1) external control, 2) placebo oil nitrofen, 3) placebo oil retinoic acid, 4) treated with retinoic acid, 5) exposed to nitrofen without CDH, 6) exposed to nitrofen with CDH, 7) exposed to nitrofen without CDH and treated with retinoic acid, 8) exposed to nitrofen with CDH and treated with retinoic acid. Nitrofen (2,4- dichloro-4'-nitrodiphenyl ether) was administered by gavage (100 mg) at 9,5 days of gestation. Retinoic acid was administered intraperitoneally on days 18.5, 19.5 and 20.5 of gestation (5 mg/kg), harvest was performed at 21.5 days (term =22 days). Each fetal subgroup was composed of 25 fetuses. The morphologic variables studied were: body weight, total lung weight, left lung weight, and total lung weight to body weight ratio. Pulmonary morphometry was studied by measuring the mean linear intercept and its components: internal diameter of airspaces and mean transection length / airspace. Vascular morphometry was studied by measuring the external diameter, internal diameter and proportionate thickness of the medial muscular layer of pulmonary resistance arterioles. Immunohistochemistry and Western blotting analysis were used to assess VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 expression. Data was analyzed using ANOVA with Tukey's post-test and immunohistochemistry was studied semiquantitatively using Kruskal-Wallis test with Dunn's post-test. The frequency of CDH was 40%. The morphological variables showed reduction in the nitrofen group with and without CDH, which were more pronounced in the latter (p<0.05). Retinoic acid did not affect fetal morphology. There was no difference in pulmonary morphometry among groups. Fetuses with CDH had increased proportionate thickness of the medial muscular layer of pulmonary arterioles, while treatment with retinoic acid reduced this variable in fetuses with CDH (p