Functional and structural studies of human septin 6, 8 and 10

Para que a divisão celular ocorra é necessário que uma célula passe por algumas etapas que possibilitem esta divisão. Ao conjunto destes processos denomina-se ciclo celular. A regulação espacial e temporal destes processos é fundamental para a preservação celular e do material genético. Falha neste processo pode levar à morte celular ou a alterações genéticas causando divisão desregulada e crescimento de tumores. Dentre diversas proteínas envolvidas no ciclo celular, encontram-se as septinas. Até o momento, foram encontrados em humanos 14 diferentes genes para septinas. Septinas são proteínas ligadoras de GTP, primeiramente caracterizadas em leveduras, que estão associadas a eventos biológicos importantes em eucariotos. Neste trabalho foram selecionadas três septinas humanas para estudos funcionais e estruturais: septina 6, septina 8 e septina 10. Nossos resultados deram origem a três artigos que descrevem: I) estratégias de clonagem, expressão, purificação e caracterização preliminar da septina humana 8; II) a capacidade das septinas 2, 6, 8 e 11 em ligar e hidrolisar GTP, mas com diferentes níveis de atividade GTPásica, sendo a septina 2 humana capaz de hidrolizar GTP mais rapidamente que as demais septinas e III) a interação entre a septina 10 humana e a proteína Promyelocytic leukemia zinc finger (PLZF), cuja expressão em linhagens celulares hematopoiéticas resultam na supressão do crescimento e interrupção do ciclo celular. A interação da septina 10 com a proteína PLZF foi confirmada in vitro por experimento de pull-down e a localização celular da septina 10 mostra que esta septina é expressa no citoplasma da célula. Além disso, resultados preliminares mostram a relação da ligação de GTP e formação de filamentos pela septina 6 e diversas estratégias para a cristalização das septinas estudadas como: microseeding, streak-seeding, variações de pH, precipitantes e aditivos, metilação de lisinas e screening de tampões, cujos resultados não foram satisfatórios para a resolução de uma estrutura de septina humanaA cell passes through some steps to enable for cell division and all these processes are called Cell Cycle. The spatial and temporal regulation of this process is crucial to maintaining cellular and genetic material. Failure in this process can lead to cell death or genetic changes causing division and unregulated growth of tumors. Among several proteins involved in cell cycle, there are the septins. To date, 14 different human genes coding for septins were found. Septins are GTP binding proteins first characterized in yeast, which are associated with important biological events in eukaryotes. In this study we selected three human septins to study functionally and structurally: septin 6, septin 8 and septin 10. Our results led to three articles that describe: i) strategies for cloning, expression, purification and preliminary characterization of human septin 8; ii) the ability of septin 2, 6, 8 and 11 to bind and hydrolyze GTP, but with different levels GTPase activity, human septin 2 is capable of hydrolyzing GTP faster than the other septins and III) the interaction between the human septin 10 and promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF), whose expression in hematopoietic cell lines results in growth suppression and cell cycle arrest. The interaction between septin 10 and PLZF was confirmed by in vitro pull down assay and the cellular localization of septin 10 shows that this septin is expressed in the cell cytoplasm. Furthermore, our studies preliminary results show the relation of GTP binding and filament formation of the septin 6 and several strategies for the crystallization of septins as micro-seeding, streak-seeding, variations in pH, precipitants and additives, methylation of lysine and screening of buffers, but the results were not satisfactory for the resolution of a human septin structur