The use of mimetic superoxide dismutase, tempol, in diabetic retinopathy experimental : implication for the development of possible pharmacological treatment of retinal complications in diabetes

A retinopatia diabética (RD) é a principal causa de cegueira adquirida em adultos em idade produtiva nos países desenvolvidos. A hipertensão (HA) é um importante fator de risco associado ao desenvolvimento da RD. O estresse oxidativo pode explicar como a hiperglicemia inicia os processos bioquímicos envolvidos na patogênese da RD. A retina possui vários mecanismos de defesa para minimizar o estresse oxidativo como “scavengers” de baixo peso molecular e sistemas enzimáticos. Sob condições do diabetes (DM), ocorre um aumento das espécies reativas, como o superóxido (O2•-) e óxido nítrico (NO•), conseqüentes da indução da reação da glicação. O produto desta reação, peroxinitrito (ONOO-), pode diretamente causar lesões em proteínas, lipídios e DNA. Embora muitos mecanismos patológicos da RD sejam focados nos danos vasculares, tem sido descrito que o DM também induza danos nas células de Müller da retina neural que pode anteceder as anormalidades vasculares. A neurodegeneração retiniana pode ser detectada pelo aumento da imunoreatividade da proteína ácidica fibrilar glial (GFAP) em astrócitos e em células de Muller. O acúmulo de matriz extracelular (ECM) é instrumental para a quebra de barreira hematoretiniana da retina presente precocemente na patogênese da RD. O objetivo deste estudo foi investigar a eficácia do antioxidante tempol, mimético da superóxido dismutase (SOD), na prevenção das alterações precoces na retina de um modelo de RD que combina hipertensão e diabetes. Foram utilizados neste estudo ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e seu controle normotenso (WKY) com 4 semanas de idade. O diabetes foi induzido experimentalmente através de injeção intravenosa de estreptozotocina. Após a confirmação da indução do DM, os ratos SHR (DM-SHR) foram randomizados para receber ou não tratamento com injeção de tempol intraperitonealmente (DM-SHR-tempol). Após 20 dias, os ratos foram eutanaziados e suas retinas foram coletadas para extração de proteínas, ensaios colorimétricos e imunohistoquímica. Os animais diabéticos apresentaram os marcadores precoces de RD: houve aumento da expressão do GFAP no grupo SHR e DM-SHR comparado ao grupo WKY e aumento da FN no grupo DM-SHR comparado ao SHR e WKY. O balanço oxidativo, avaliado pela produção de superóxido e pelos produtos finais do óxido nítrico, assim como a defesa antioxidante, estimada pela expressão e atividade da Cu/Zn SOD, revelou um desequilíbrio acentuado no grupo DM-SHR em relação ao grupo SHR e WKY. Como resultado, o produto peroxinitrito detectada por imuno-histoquímica para nitrotirosina (NT) foi maior no grupo DM-SHR. A atividade da enzima poli (ADPribose) polimerase (PARP) detectada pela ribosilação, e a super regulação da expressão da óxido nítrico sintase induzida (iNOS) foram exacerbadas neste grupo. A administração do TEMPOL impediu o dano oxidativo, reduziu a ativação exacerbada da PARP e diminuiu os níveis de i-NOS nos ratos DM-SHR. Como conseqüência, os marcadores estruturais precoce da RD, GFAP e FN, foram prevenidos pelo TEMPOL. Estes resultados fornecem uma base racional para o desenvolvimento com fins farmacológicos do TEMPOL na prevenção e tratamento da RD.Diabetic retinopathy (DR) is the leading cause of blindness among working-age adults in developed countries. Hypertension (HA) is an important risk factor associated with the development of DR. Oxidative stress may explain how the hyperglycemia initiates the biochemical processes involved in the pathogenesis of DR. The retina has several defense mechanisms to minimize oxidative stress as scavengers of low molecular weight and enzyme systems. Under conditions of diabetes (DM), there is an increase of reactive species such as superoxide (O2• -) and nitric oxide (NO •), induced by glycation reaction. The product of this reaction, peroxynitrite (ONOO-), can directly damage proteins, lipids and DNA. Although many pathologic mechanisms of DR have been focused on vascular damage, it has been reported that DM also induces damage in nonvascular retinal neurons of Müller cells occurred prior to vascular abnormalities. The retinal neurodegeneration can be detected by increased immunoreactivity of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in astrocytes and Muller cells. The extracellular matrix accumulation (ECM)) is instrumental to blood retinal barrier breakdown present in early pathogenesis of DR. The objective of this study was to investigate the efficacy of the antioxidant TEMPOL, mimetic of superoxide dismutase (SOD) in the prevention of early changes in the retina in a model that combines hypertension and diabetes. Four-week-old spontaneously hypertensive rats (SHR) and their normotensive control (WKY) were used in this research. Diabetes was induced experimentally by intravenous injection of streptozotocin. SHR diabetic (DM-SHR) rats were andomized to receive or not treatment with intraperitoneal injection of tempol (DM-SHR-tempol). fter 20 days, the rats were euthanized and their retinas were collected for protein extraction, colorimetric assays and immunohistochemistry. The presence of exacerbated early markers of DR was detected by increased GFAP expression in SHR and SHR-DM group compared to WKY and FN in group DM-SHR compared to SHR and WKY. The oxidative balance, evaluated by superoxide production and nitric oxide end-product levels and the counterpart antioxidant defense, estimated by the expression and activity of Cu / Zn SOD showed a marked unbalance in DM-SHR group compared to SHR and WKY group. As a result, the product peroxynitrite detected by immunohistochemistry for nitrotyrosine (NT) was higher in the DM-SHR. The activity of the enzyme poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) detected by ribosylation, and the upregulation of inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression were exacerbated in this group. The administration of TEMPOL prevented the oxidative damage, reduced the exacerbated activation of PARP and decreased iNOS levels in DM-SHR rats. As a result, the structural markers of early RD, GFAP and FN, were prevented by tempol. These findings provide a rationale for the development with pharmacological purposes of tempol in the prevention and treatment of DR