Cloning and heterologous expression of genes responsible for synthesis of polyhydroxybutyrato em Bradyrhizobium elkanii

Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros de hidroxialcarioatos produzidos, e acumulados, intracelularmente, como fonte de carbono e/ou outros materiais energéticos, em vários microorganismos. Freqüentemente, o acúmulo dos PHAs ocorrem em condições abaixo do limite nutricional de elementos como N, P, S, O ou Mg e excesso de carbono, podendo representar até 80% da massa seca total da célula. Mais de 300 diferentes microorganismos podem sintetizar e acumular PHAs. O polihidroxibutirato (PHB) é o mais conhecido dentre os polímeros bacterianos biodegradáveis denominados polihidroxialcanoatos. Por ter propriedades semelhantes ao polipropileno, o PHB pode ser usado na fabricação do plástico biodegradável. Além da busca por maior produção de tal polímero, pouco é conhecido sobre seu papel biológico, em especial nos rizóbios. Estudos revelaram que há variação na capacidade da produção e acúmulo de PHB nessas bactérias quando em simbiose, dependendo da espécie em questão e das condições de cultivo das mesmas, observando-se bactérias incapazes de acumular PHB quando bacterióides, como é o caso do Rhizobium meliloti, ou capazes de produzir e acumular PHB, nessas condições, como é o caso de Rhizobium etli, Bradyrhizobium japonicum e Bradyrhizobium elkanii. Desta forma, este trabalho teve por objetivo a identificação dos genes responsáveis pela síntese de PHB em Bradyrhizobium elkanii, clonagem e expressão dos mesmos em Escherichia coli, uma vez que esta bactéria é bem conhecida como ferramenta molecular e se multiplica rapidamente, podendo atingir uma alta produção do polímero esperado, em um curto período de tempo. Além disso, objetivou-se, também, aumentar a produção de PHB em B. elkanii através de mutações aleatórias (através da inserção do transposon TnphoA), já que esta é uma bactéria naturalmente produtora de PHB. Para isso, os genes phbA, phbB e phbC foram isolados através da técnica de PCR, amplificando-se os genes inteiros. Estes foram clonados em vetores de expressão tipo pET (NOVAGEN), sendo os genes phbA e phbB clonados em "operon " em um mesmo vetor e o gene phbC clonado separadamente. A expressão dos genes foi analisada, bem como sua capacidade de produzir PHB. Os mutantes de B. eíkanii obtidos através da inserção do transposon TnphoA foram analisados com o uso do corante Sudan Black, procurando-se selecionar linhagens maiores produtoras de PHB. A produção dos mutantes selecionados foi, posteriormente, analisada por cromatografia gasosa. Observou-se que a linhagem de E.coli com os três genes clonados teve a capacidade de produzir PHB, porém com baixa eficiência. Já os mutantes aleatórios de B. elkanii apresentação diferentes acúmulos em relação ao selvagem, com destaque para o MUT33 que teve 72% da sua massa seca acumulada na forma de PHB, enquanto o selvagem acumulou 51 % de PHB, nas mesmas condiçõesPolyhydroxyalkanoates (PHAs) are polymers of hydroxyalkanoate acids, produced and accumulated intracellularly as a source of carbon and energy storage material, in prokaryotic cells. Often, the PHAs accumulation occurs in conditions when the carbon source is in excess but one or several other nutrients are limited, and may represent up to 80% of the cell dry weight. More than 300 different microorganisms can synthesize and accumulate PHAs. The polyhydroxybutyrate (PHB) is the most studied polymer among the bacterial biodegradable polymers (PHAs). By having properties similar to polypropylene, PHB can be used in the manufacture of biodegradable plastic. On the search for greater production of such polymer, little is known about its biological role, especially in the genus Rhizobium. Studies have shown that there is a variation in the PHB capacity production and accumulation when these bacteria are in symbiosis. Depending on the species and cultivation conditions it has been observed either incapacity of PHB production and accumulation, when Bacteroides, as Rhizobium meliloti; or capacity and accumulation of PHB under bacteroides fase, as Rhizobium etli, Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium elkanii. Therefore, the present work aimed the identification, cloning and expression, in Escherichia coli, of responsible genes for PHB synthesis in Bradyrhizobium elkanii. Moreover, it was also expected to increase the production of PHB in B. elkanii, through random mutations (insertion of the TnphoA transposon), since B. elkanii is a good natural producer of PHB. For this, the entier phbA, phbB and phbC genes were isolated by PCR. Those genes were cloned in expression vectors such pET (NOVAGEN), where phbA and phbB genes were cloned in operon, in a single vector, whereas phbC gene was cloned separately, in another vector. The expression of those genes was analyzed, as well as its ability to produce PHB. Mutants B. elkanii, obtained by insertion of the TnphoA transposon, were analyzed using the dye Sudan Black, in order to select different strains that might produce higher quantities of PHB. The production of PHB by mutants was then analyzed by gas chromatography. It was observed that the E. coli with the three cloned genes had the ability to produce PHB, but with low efficiency. The B. elkanii random mutants show different accumulation compared to the wild, especially MUT33 that had 72% of its dry mass accumulated in the form of PHB, while the wild 51% of accumulated PHB under the same condition