Obtention and application of isoflavone standards from soybeans

O uso de padrões analíticos em análises cromatográficas é de fundamental importância para obter resultados analíticos confiáveis tanto em processos de validação de métodos quanto em análises rotineiras. Porém, o custo dos padrões de referência e sua disponibilidade para comercialização tornam o processo analítico muito caro e demorado. Neste trabalho foram obtidos padrões analíticos de isoflavonas de soja através da cromatografia líquida preparativa. Inicialmente foi desenvolvida uma método analítica por cromatografia líquida de alta eficiência, para separação e identificação de isoflavonas em extrato seco de soja. A seguir, foi realizada a transposição da escala analítica para a escala preparativa, iniciando pelo método da transposição direta. A caracterização e a pureza das isoflavonas obtidas foram verificadas a partir da pureza cromatográfica e pelos espectros na região do ultra violeta e visível, complementados pela espectrometria de massas e pela ressonância magnética nuclear. Os padrões obtidos por cromatografia preparativa apresentaram um teor de pureza de 93,1 % para daidzina, 99,8 % para daidzeína, 89,5 % para genisteína e 87,7 % para glicitina, permitindo, assim, o seu uso como padrões em análises rotineiras. Para demonstrar a aplicabilidade dos padrões obtidos, foi desenvolvido e validado um método para extração, hidrólise ácida e determinação das isoflavonas agliconas contidas em grãos de soja. Os resultados do conteúdo total de isoflavonas foram 283,5 ± 10,7 mg/100 g para soja não transgênica (BRS133) e 228,2 ± 13,8 mg/100 g para soja transgênica (BRS245RR), demonstrando diferenças significativas no conteúdo destas duas variedades de soja.The use of analytical standards in chromatographic analyses is very important to get trustworthy analytical results for validation of methodologies and for routine analyses. However, the cost of the available reference standards is high, prejudicing the overall analytical process. In this work, a transposition from analytical to preparative scale was carried out to obtain analytical standards of isoflavones from soybeans. An analytical methodology using high performance liquid chromatography (HPLC) was developed for separation and identification of isoflavones in dry soy extract. The transposition of the analytical parameters to the preparative scale was done initially through direct transposition. The characterization and purity of the isoflavones was determined by HPLC with spectra from a DAD detector, complemented by mass (MS+/-) and nuclear magnetic resonance spectrometries. The resulting isoflavone purities, after preparative separation and lyophilization, were 93.1 % for daidzin, 99.8 % for daidzein, 89.5 % for genistein and 87.7 % for glycitin, allowing their use as standards in routine analyses. To demonstrate the applicability of the standards obtained, an approach for extraction, acid hydrolysis and determination of the total amounts of isoflavone aglicones in soybeans was developed and validated. The results indicated total isoflavone contents of 283.5 ± 10.7 mg/100 g for non-transgenic (BRS133) and 228.2 ± 13.8 mg/100 g for transgenic (BRS245RR) soybeans, demonstrating significant differences in the isoflavone content of these two different soybeans