Effect of nitric oxide on platelet adhesion : cyclic GMP dependent and independent mechanisms

A inibição da adesão de plaquetas ao subendotélio é fundamental na prevenção de agregação excessiva e de formação de trombos, sendo o óxido nítrico (NO) o principal mediador envolvido neste fenômeno. O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo de ação do NO na inibição da adesão de plaquetas humanas, procurando identificar os mecanismos dependentes e independentes de GMP cíclico (GMPc). Os ensaios de adesão foram realizados em placas de 96 poços recobertos com fibrinogênio, usando-se plaquetas lavadas (1,2 x 108 plaquetas/mL) obtidas de indivíduos sadios. Dependendo do protocolo experimental, as plaquetas não ativadas e ativadas com trombina (50 mU/mL) foram incubadas com SNP (0,1-1,0 mM) ou SIN-1 (0,1-1,0 mM), na ausência ou na presença de ODQ (inibidor da guanilato ciclase solúvel), SOD (seqüestrador do ânion superóxido) ou gaiato (antioxidante seqüestrador de peroxinitrito). A adesão foi avaliada aos 15 e 60 min de incubação, medindo-se a atividade da fostase ácida. Nossos resultados mostraram que as plaquetas se aderem significativamente ao fibrinogênio in vitro, sendo a resposta em 60 min maior do que em 15 min. O tratamento das plaquetas com SNP (0,1 e 1,0 mM) elevou significativamente os níveis de GMPc e reduziu a adesão plaquetána aos 15 e 60 min. A pré-incubação das plaquetas com ODQ impediu a elevação dos níveis de GMPc induzida pelo SNP (ambas as concentrações e tempos), e reverteu a inibição da adesão plaquetária observada com 0,1 mM de SNP Entretanto, o ODQ não modificou a inibição da adesão quando se usou 1,0 mM de SNP. Por outro lado, a pré-incubação das plaquetas com SOD ou gaiato reverteu significamente o efeito inibitório de 1 mM de SNP. Resultados semelhantes foram obtidos com o SIN-1 em todas as condições experimentais. No sentido de descartar que a inibição da adesão plaquetária proporcionada pelos doadores de NO não é decorrente de efeito citotóxico, realizamos ensaios de citotoxicidade (MTT). Nossos dados revelaram que o SNP não é tóxico à plaqueta em nenhuma das concentrações e condições usadas. Por outro lado, o SIN-1 mostrou-se tóxico na concentração de 1 mM, sendo este efeito citotóxico revertido pela pré-incubação das palquetas com SOD. Numa segunda etapa deste trabalho, passamos à investigação do componente independente de GMPc responsável pela inibição da adesão plaquetária em resposta ao SNP e SIN-1, dando ênfase à nitrotirosina. A incubação de plaquetas com SNP (0,1 mM) por 15 min não revelou nenhuma proteína nitrada, mas quando as plaquetas foram tratadas com concentração maior de SNP (1 mM) ou SIN-1, houve o aparecimento de uma nitração de proteína nos resíduos de tirosina com uma massa molecular aparente de 110 kDa, identificada como alfa-actinina-1. A nitração foi aumentada em plaquetas ativadas com trombina. Por outro lado, amostras de plaquetas tratadas com SNP ou SIN-1 (0,1 e 1 mM) por 60 min não mostraram nitração de proteína nos resíduos de tirosina. No conjunto, estes dados sugerem que o NO inibe a adesão de plaquetas não ativadas e ativadas, por mecanismos dependentes e independentes de GMPc sendo que a nitração da a-actinina 1 plaquetária, parece ser o principal mecanismo responsável pelo componente independente de GMPc. Paralelamente, observamos que em concentrações elevadas, o SIN-1 diminui a viabilidade e a atividade da fosfatase ácida das plaquetas devido à formação de ânion superóxidoThe inhibition of platelet adhesion to the subendothelium by nitric oxide (NO) is essential in preventing excessive aggregation and thrombus formation The objective of this work was to investigate the mechanisms of the NO on inhibition of human platelet adhesion looking for identify of the cGMP-dependent and independent mechanisms Adhesion assay was carried out in the 96-well microtiter plates coated by fibrinogen, using washed platelet (1,2 x 108 plaquetas/mL) from healthy volunteers. Depending on the experimental protocols, non activated or thrombin (50 mU7ml_)-activated platelets were incubated with NO donors (SNP or SIN-1), guanylyl cyclase inhibitor (ODQ), O2" scavenger (SOD) and -(-) epigallocatechin gallate, and allowed to adhere to the wells for either 15 or 60 min at 37°C. Cell toxicity was estimated using the MTT assay by platelets after exposure to NO donors. Nitrated proteins were detected by immunobloting. Purification and identification of them were done by Western blotting analysis and mass spectrometry respectively. Significant platelet adhesion was achieved when non-activated and activated platelets were kept on plates for 15 min or 60. The adhesion was significantly increased when platelets were activated with of thrombin. SNP (0,001 - 1000 nM) inhibited significantly both non-activated and thrombm-stimulated platelet adhesion. The MTT reduction assay showed that the exposure of platelets to SNP (0 1 and 1 mM) caused any toxic effect. Pretreatment of platelets with ODQ nearly abolished SNP (0.1 mM)-mediated cGMP elevation and the inhibition of platelet adhesion, but failed to affect the inhibitory effect of SNP (1 mM) on cell adhesion. Pre-incubation of platelets with SOD, reversed the effect of SNP 1mM. Epigalocatechin gallate did not affect the effect of SNP at 0.1 mM: on the other hand, reduced this effect at 1mM SNP. SIN-1 (0,001 - 100 jiM) concentration-dependently inhibited both non-activated and thrombin-stimulated platelet adhesion. In the higher concentration (1 mM), the SIN-1 inhibited almost all platelet adhesion. Pretreatment of platelets with ODQ markedly reverted the increased the levels of cGMP as well as decreased the inhibition of platelet adhesion by SIN-1 at 0,1 mM. SOD did not change the SIN-1 (0,1 mM)- mediated platelet inhibition, but reverted the platelet inhibition in all another conditions. MTT assay showed that the SIN-1 at 1 mM caused toxic effect in the platelets, and this effect was restored by SOD ECG did not affect the effect of SIN-1, excepted in the small concentration, when the inhibitory effect of thrombin-activated platelets was decreased. Immunobloting indicated the presence of nitrated protein that was recognized as alpha-actinin 1. In conclusion, cGMP-dependent and -independent mechanisms contribute to inhibition of platelet adhesion by NO, and that the a-actinic nitration can be the most important c GMP-independent mechanism. Parallel of this, we observed that the high concentration of SIN-1 decreased the viability and acid phosphatase activity by formation of superoxide anio