Isolamento, purificação e caracterização bioquimica da peroxidase de carambola (Averrhoa carambola, L.)

Peroxidases (POD, EC 1.11.7.1 doador: peróxido de hidrogênio oxidoredutase) são um grupo de isoenzimas responsabilizadas pelo surgimento de alterações da coloração natural dos alimentos e sabor desagradável; são usadas em análises de alimentos, clínicas, e em conjunto com outras enzimas, na conservação de certos alimentos. Muitas frutas como a carambola (Averhoa carambola, L.) ainda não tiveram suas peroxidases avaliadas quanto às suas propriedades bioquímicas. Esse trabalho teve como objetivo isolar, purificar e caracterizar bioquimicamente a peroxidase de carambola. A localização histoquímica da peroxidase realizou-se mergulhando fatias de carambolas verdes, verde-maturas e sobre-maduras em mistura de reação constituída de 1 % de guaiacol em tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 6,0, e 0,1 M de peróxido de hidrogênio. A evolução do escurecimento foi acompanhada e fotografada. A localização em frutas verdes e verde-maturas restringiu-se às partes mais fibrosas: junto aos feixes vasculares que atravessam a polpa, ao talo central e gineceu e à casca. Em fatia de carambola sobre-madura a polpa adquiriu coloração do tetraguaiacol e houve extravasamento do composto colorido para o meio de reação, indicando a presença de maior quantidade de enzima solúvel. Partes de carambola, casca, polpa e talo central com gineceu foram analisadas separadamente, após extração da POD com tampão mais eficiente, fosfato de potássio 0,2 M pH 8,0. Os resultados encontrados na localização histoquímica foram confirmados. Talo central com gineceu apresentaram maior atividade por grama da parte da fruta, seguido pela casca; polpa apresentou atividade considerável. apenas em carambolas sobremaduras. Carambolas verdes renderam maior atividade POD por grama, na soma das partes. Foram testados o efeito da adição de 0,2 M de CaCI2,2% de PVP, 2% de PEG, 0,01 M de EDTA e 0,01 M de ácido L-ascórbico, isoladamente ou em combinação ao tampão de extrato fosfato de potássio 0,2 M ou à água destilada, na extração de peroxidase insolúvel de carambola, sendo que a melhor combinação foi tampão fosfato 0,2 M pH 8,0 contendo 0,2 M CaCI2, 2% PEG e 0,01 M de EDTA. O extrato total, obtido pela extração com os aditivos acima citados e 0,1% de Triton X-10O, rendeu 1,29 vezes mais POD que a soma das extrações em seqüência: 1) Enzima Livre: extraída em água destilada, contendo PEG e EDTA, ressuspendendo e extraindo o precipitado por duas vezes; 2) Enzima ionicamente ligada: ressuspendendo o último precipitado de (1) em tampão fosfato de potássio 0,2 M pH 8,0, contendo CaCb, repetindo a operação por duas vezes e, 3) Enzima solúvel com Triton X-100: ressuspensão do último precipitado de (2) no tampão de extração (2), contendo 0,1% de Triton X-100. Nos ensaios de precipitação da peroxidase, sulfato de amônio a 90% de saturação preservou apenas 3% mais atividade por grama de carambola que a adição de 65% de acetona ?Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digitalPeroxidases (POD, EC 1.11.7.1 donor: hydrogen peroxide oxydoreductase) are a group of isoenzymes whose action results in discoloration and off-flavours in foods, but are also used in food and clinical analyses, as well as in food conservation, combined with the action of other enzymes. A lot of tropical fruits and vegetables have yet to be biochemically characterised with respect to their peroxidases. This study aimed at to isolating, purifying and characterising the peroxidase from carambola (Averrhoa carambola, L.) fruit. The histochemical localisation of peroxidase from carambola was carried out by immersing slices of green, green-mature and overripe carambolas in a reaction mixture of 1% guaiacol in 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0 and 0.1 M hydrogen peroxide. The development of browning was observed and photographed. In green and green-mature slices the POD was localised near the fibrous parts such as vascular bundles, internal stem, gynoecium and peel. In overripe slices the colouring of the pulp and the reaction medium could be seen, indicating the presence of greater amounts of soluble POD at this stage of maturation. Separate analysis of POD activity in the parts: internal stem with gynoecium, pulp and peel of carambola, confirmed the findings of the histochemical localisation. The internal stem with gynoecium had the highest activity per gram of fruit part, followed by the peel. The pulp showed appreciable activity only in overripe fruits. Green carambolas showed the highest POD activity in relation to the other maturation stages tested. The best extraction buffer was found to be 0.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.0. The extraction of POD activity with the addition of other chemical substances, showed that the addition of 0.2 M CaCI2,2% PEG and 0.01 M EDTA in 0.2 M potassium phosphate buffer, pH 8.0, was the best medium for total extraction. The total extract yielded 1.29 times the amount of POD activity as the sum of sequential extractions: Soluble enzyme (three times), lonically bound enzyme (three times) and Triton X-100 soluble enzyme (an other three times). Precipitation studies using 65% solutions of ethanol or acetone and 90% saturation of ammonium sulphate showed that ammonium sulphate resulted in only 3% more activity per gram of fruit than acetone ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertation