Investigation of neuroprotective action of ciliary neurotrophic factor (CNTF) fused to a protein transduction domain (PTD)

O fator neurotrófico ciliar (CNTF) despertou grande interesse com a descoberta do seu efeito neuroprotetor sobre motoneurônios após secção de nervos periféricos em ratos neonatos e camundongos adultos. Contudo, seus efeitos colaterais de perda de peso e caquexia impedem seu uso clínico. Uma via alternativa muito promissora, no sentido de eliminar estes efeitos colaterais, parece ser a administração do CNTF conjugado com peptídeos que possuem domínio de translocação de proteínas (PTD-protein transduction domain). Previamente, mostramos que o CNTF conjugado a um PTD derivado da proteína tat do vírus HIV-1 (TAT-CNTF) também tem efeito protetor sobre motoneurônios e não produziu efeitos colaterais no tratamento, por 5 dias, de ratos neonatos (P2-P7) que sofreram secção do nervo isquiático. O presente trabalho teve como objetivo investigar se a administração da TAT-CNTF por tempos mais prolongados seria capaz de manter a sobrevivência de motoneurônios e neurônios sensoriais, bem como de estimular a regeneração axonal, sem a ocorrência dos efeitos colaterais do CNTF. Desta forma, ratos Wistar neonatos (P2) receberam tratamento subcutâneo com CNTF (1,2mg/g/dia) durante 5 dias, TATCNTF (1,2mg/g/dia) ou PBS durante 5 ou 15 dias. Ao final do período de tratamento os animais foram sacrificados por decapitação, sendo coletado para posterior análise o sangue e gorduras marrom interescapular, branca retroperitonial e branca epididimal. Um outro grupo de animais tive o nervo isquiático esquerdo esmagado em P2 e recebeu o mesmo tratamento. No período entre 20 e 60 dias de vida foi realizada a avaliação da recuperação funcional motora por meio de Walking Track Test, e da recuperação funcional sensitiva através da medida do limiar da resposta de retirada da pata a um estímulo elétrico. No 30º ou 60º dia de vida foi realizada marcação retrógrada de neurônios cujos axônios compõem o nervo isquiático utilizando-se Amina Dextrano Biotinilado (BDA). Após 7 dias, os animais foram sacrificados, sendo coletada a intumescência lombar, os gânglios sensoriais L4 e L5 e o nervo isquiático para análise histológica. As análises dos níveis plasmáticos de glicose, triglicérides e ácidos graxos revelaram que o tratamento com TAT-CNTF ou CNTF por igual período (5 dias) produziu modificações no metabolismo energético em relação aos ratos controle (PBS), contudo diferiram quanto à intensidade dos efeitos produzidos. O tratamento prolongado com TAT-CNTF (15 dias) produziu significantes alterações nas concentrações plasmáticas de triglicérides e de colesterol. Entretanto, o tratamento com TAT-CNTF (5 ou 15 dias) produziu efeitos reduzidos sobre os tecidos adiposos quando comparados ao tratamento com CNTF. Os ratos do grupo TAT-CNTF apresentaram peso corporal significativamente menor que aqueles do grupo PBS a partir do 9º dia de tratamento, porém o grupo CNTF apresentou menor peso a partir do 2º dia. Em ambos tratamentos houve reversão desse efeito sobre o peso corporal, porém esta ocorreu mais precocemente nos ratos do grupo TAT-CNTF (P25) quando comparados ao grupo CNTF (P32). A recuperação funcional motora e sensorial dos grupos CNTF e TAT-CNTF foi 50% superior ao grupo controle. Os grupos CNTF e TAT-CNTF também apresentaram maior número de neurônios sensoriais e motores BDA positivos, além de maior número de axônios mielínicos no nervo isquiático quando comparados ao grupo controle. Nossos resultados mostraram que o tratamento com TAT-CNTF, mesmo por períodos mais longos, promoveu a sobrevivência e regeneração axonal de motoneurônios e neurônios sensitivos sem a ocorrência dos efeitos colaterais produzidos pelo tratamento com CNTF. Além disso, tais propriedades da TAT-CNTF contribuíram significativamente para a recuperação funcional motora e sensorial após lesões nervosas periféricasCiliary neurotrophic factor (CNTF) is known as a neuroprotective agent on motoneurons after peripheral nerve section in neonatal rats and adult mice. However, side effects like weight loss and caquexia have limited its clinical use. A promising approach for the avoidance of such side effects is the fusion of a protein transduction domain (PTD) with CNTF. Previously we showed that CNTF fused with HIV-1 PTD (TAT-CNTF) also had protective effect on motoneurons and did not produce side effects in a 5 days treatment of sciatic nerve transected neonatal rats (P2-P7). The aim of the present work was investigate if the TAT-CNTF administration for long time was capable to support the motoneurons and sensory neurons survival, as well as to stimulate the axonal regeneration, without CNTF side effects. Thus, neonatal Wistar rats (P2) were subcutaneously treated with CNTF (1.2mg/g/day) for 5 days, TAT-CNTF (1.2mg/g/day) or PBS during 5 or 15 days. By the end of treatment rats were killed by decaptation and blood, intrascapular brown adipose tissue and retroperitonial and epididimal white adipose tissue were collected for further analysis. Another group of animals had the left sciatic nerve crushed (NCE) in P2 and received the same treatment. From 20 to 60 days of age a Walking Track Test was performed in order to evaluate the motor function recovery, and the threshold for paw withdraw was used as a measure of sensitive functional recovery. The retrograde labeling of sciatic nerve neurons using Biotinilated Dextran Amine (BDA) was performed at 30 or 60 days of age. Rats were killed after 7 days and the lumbar enlargement, L4 and L5 dorsal root ganglia and the sciatic nerve were collected for histological analysis. The analysis glucose, triglycerides and fatty acid plasmatic levels demonstrated that 5 days TAT-CNTF or CNTF treatment induced changes in energy metabolism compared to control rats, however the effects of these treatments had different intensities. The long term treatment with TAT-CNTF (15 days) induced important changes in triglycerides and cholesterol plasmatic levels. However TAT-CNTF treatment (5 or 15 days) had reduced effects on adipose tissue when compared to CNTF. After the 9th day of treatment the TAT-CNTF group had a smaller body weight when compared to the PBS group, on the other hand the CNTF group had a smaller body weight after the 2nd day compared to the PBS group. In both treatments (CNTF and TATCNTF) there was a reversion of the body weight effect, however this was earlier in the TAT-CNTF group (P25) than on the CNTF group (P32). The motor and sensorial functional recovery of CNTF and TAT-CNTF groups was 50% greater than the control group. CNTF and TAT-CNTF groups also displayed a greater number of BDA positive motor and sensory neurons, and more myelinic axons in the sciatic nerve compared to the control group. Our results demonstrate that TAT-CNTF long term treatment was able to promote the survival and axonal regeneration of motor and sensory neurons without important CNTF related side effects. Moreover, TAT-CNTF properties had significant contribution for the motor and sensory functional recovery after peripheral nerve lesion