Desenvolvimento de metodologia para determinação simultanea, por CLAE das vitaminas B1, B2, B6, acido nicotinico e nicotinamida em alimentos enriquecidos

O controle dos níveis de enriquecimento de alimentos, pela adição de vitaminas, tem sido dificultado, especialmente, pela falta de metodologias apropriadas. Visando suprir esta deficiência, foi desenvolvida e. avaliada uma metodologia para determinação simultânea das vitaminas B1, B2, B6, ácido nicotínico e nicotinamida em alimentos enriquecidos, utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O método desenvolvido foi aplicado na determinação dessas vitaminas em 50 diferentes tipos/marcas de alimentos enriquecidos, como biscoitos de maisena (marca comercial grafada com Z, registrada), de leite, maria, coco e recheados, farinhas de cereais, farinhas lácteas, flocos de milho, macarrões, bebidas lácteas aromatizadas, leite em pó e esterilizado, bebida dietética e um complemento alimentar para desenvolvimento de massa muscular. As vantagens do método proposto, em relação aos métodos oficiais, são, além da determinação simultânea de 4 vitaminas (Bl, B2, B6 e PP, incluindo as duas formas desta última, ácido nicotínico e nicotinamida), simplicidade e versatilidade das etapas de extração e limpeza, utilização de reagentes com menores níveis de toxicidade, uso de detector UV, em substituição ao de fluorescência, eliminação de reações de derivação e rapidez. A extração multivitamínica é feita com ácido sulfúrico diluído, através de vibração ultra-sônica. A precipitação do extrato com metanol, seguida de refrigeração, é satisfatória tanto na eliminação de interferentes, quanto na prevenção de precipitação na coluna cromatográfica. A eluição por gradiente é importante para a obtenção de boa resolução das vitaminas, sendo que todas as vitaminas são eluídas em 23 min de corrida. O tempo necessário para o re-equilíbrio da coluna é de 20 mino A detecção é feita na região do ultravioleta e a quantificação é feita por curvas de padronização externa. Os limites de detecção e recuperação, nos níveis médios de enriquecimento, foram, respectivamente, 0,04 μg/ml e 102% para a vitamina B1, 0,03 μg/ml e 96% para a B2, 0,08 μg/ml e 106% para a B6, 0,10 μg/ml e 105% para a nicotinamida e 0.03 μg/ml e 81% para o ácido nicotínico. Os testes de repetibilidade, nos níveis de enriquecimento, apresentaram um coeficiente de variação médio inferior a 5% para as vitaminas B1, B2 e nicotinamida, inferior a 10% para a vitamina B6 e inferior a 13% para o ácido nicotínico. Entre os alimentos enriquecidos analisados, todos os diferentes tipos de biscoitos, de 1 única marca, apresentaram apenas 30 % dos valores de vitamina B2 descritos nas embalagens dos produtos; os flocos de milho, de 4 diferentes marcas, apresentaram menos de 30% dos níveis vitamínicos declarados; macarrões, de 1 única marca, não apresentaram nenhuma das vitaminas descritas nas embalagens do produto e o complemento alimentar para desenvolvimento de massa muscular apresentou níveis de B1, B2 e nicotinamida superiores a 300% dos valores declarados. Menores variações também foram observadas em alguns dos outros produtos analisados. Os resultados obtidos neste trabalho, além de demonstrarem as vantagens e aplicabilidade da metodologia desenvolvida, apontam para a necessidade de maior rigor no controle das taxas de enriquecimento destes alimentos.The control of enrichment levels in foods is difficult mainly due to the lack of appropriate analytical methodology. A new method for the simultaneous determination of nicotinamide, nicotinic acid, ribotlavin, thiamin and pyridoxine in enriched Brazilian foods by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed and evaluated. The new method was employed to determine the vitamin B group in a survey of fifty products, such as cornflour, milk, coconut and sandwich biscuits, cereal flour, lacteous flours, com flakes, macaroni, flavored milk, whole and skim milk powder, acidified milk powder, steritized whole milk, flavored diet drinks and flavored mix for milk-based diet drink. In addition to the simultaneous determination of four vitamins (Bl, B2, B6 and two diferent forms of PP), the advantages of the method developed are: simplicity and improvement in the extraction and cleaning procedures, no use of toxic reagents, use of the UV detector instead of the fluorescent detector, elimination of derivatization reactions and speed in comparison with the official methods. The multivitamin extraction with sulfuric acid in an ultrasonic wave vibrator proved effective. The methanol solution provided partial purification of the extract and prevented precipitation on the analytical column. Neverthless, a gradient elution was necessary in order to get good resolution of the compounds. As the amounts of vitamins in enriched foods are normally greater than usual, the detection can be made using a UV detector. Quantitative data were obtained using calibration curves constructed by plotting peak area versus concentration. Quantification limits of the method and recoveries, in average enrichment levels, were 0.04 μg/ml and 102% for vitamin B1, 0.03 μg/ml and 96% for B2, 0.08 μg/ml and 106% for B6, 0.10 μg/ml and 105% for nicotinamide and 0.03 μg/ml and 81% for nicotinic acid, respectively. Repeated.injections showed a relative standard deviation lower than 5% for vitamin B1, B2 and nicotinamide, 10% for vitamin B6 and 13% for nicotinic acid, respectively. In some of the products analized the vitamin levels agreed with those printed on the package. Although some slight quantitative variations were found within biscuits, one sample had levels of ribot1avin 35% lower than the value stated on the package. Of five different com cereal brands, only one had the declared vitamin content, the others were 30% lower. No B-group vitamins were detected in one brand of enriched macaroni, except for the nicotinic acid naturally present in the t1om. On the other hand, one t1avored milk drink exhibited vitamins levels 200% higher than the amounts stated on the label and one milk drink mix had thiamin, ribot1avin and nicotinamide levels 3 to 5 times greater than stated. These results suggest an absence of control of the amount of vitamins in enriched foods