Produção, purificação, caracterização bioquimica e aplicações da lipase de Alcaligenes sp

Quinhentas e cinquenta linhagens de microrganismos foram isolados do solo, frutas, resíduos industriais e testados quanto à capacidade de hidrolisar glicerídeos em meio alcalino. Cinco linhagens de bactérias foram selecionadas como produtoras de lipase alcalina. Entre elas, uma linhagem identificada como Alcaligenes sp., apresentou alta produção de lipase alcalina em meio de cultivo composto por: 2% de farinha de soja torrada, 1% farinha de trigo, 0,5% de K2HPO4, 1 % de água de maceração de milho (com steep liquor) e 0,2% de Na2CO3. A enzima lipolítica de Alcaligenes sp. hidrolisou as ligações éster de triglicerídeos insolúveis em água, podendo assim, ser classificada como lipase (Glicerol Éster Hidrolase E.C.3.1.1.3). Estudou-se a produção da lipase extracelular pela linhagem selecionada, a caracterização da enzima no estado bruto e a purificação através de fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia em coluna DEAE- Sephadex A-50. Na purificação das proteínas, foram detectadas 2 frações com atividade de lipase, sendo denominadas de frações I e II. As frações foram coletadas e concentradas em membrana de ultrafiltração. A fração I apresentou atividade ótima. em pH 8 a 40°C. A fração II apresentou atividade ótima em pH 9 a 45°C. A presença de MgSO4 e CaCl2 provocaram um aumento da atividade enzimática das duas frações, por outro lado, ZnSO4 e FeSO4 inibiram moderadamente a atividade enzimática de ambas frações. Os reagentes cisteína e f3-mercaptoetanol inibiram significativamente a atividade enzimática das frações I e II. A esterificação de ácido graxo e glicerol pela lipase bruta de Alcaligenes sp. foi examinada e verificou-se que a enzima esterificou apenas 34% após 48 horas de incubação. A lipase bruta de Alcaligenes sp. mostrou-se estável na presença de detergentes e protease a pH 9The screening of alkaline lipase of producing microorganisms was performed using 550 strains of microorganisms wich were isolated from samples of soil, fruits and industrial residues. It was found that five strains of bacteria produced high activity of extracellular lipase and one of them produced exceptionally high alkaline lipase activity. This strain was identified as Alcaligenes sp. The medium for lipase production was composed of 2% roasted soybean meal, 1 % wheat meal, 0,5% K2HP04, 1 % of com steep liquor and 0,2% Na2C03. Maximum enzyme activity with olive oil as substrate was observed at pH 9,0 at 45°C. The enzyme extract was purified by fractionation with ammonium sulfate and DEAE Sephadex A-50 column chromatography. In the elution between 0,lM and 0,3M of NaCI, two active fractions were separately, collected, concentrated by ultrafiltration on membrane and characterized. It was observed that optimum pH activity for the fraction I was 8,0 at 40°C with olive oil as substrate. The optimum pH activity for the fraction II was 9,0 at 45°C with olive oil as substrate. The effects of various metal ions and other reagentes at the final concentration of 1 mM on the lipase activity were studied. The fractions I and II were inhibited by ZnS04 and FeS04, on other hand CaCl2 and MgS04 increased the activity. Both fractions were inhibited by f3- mercaptoethanol and cysteine. The enzimatic esterification using oleic acid and glycerol by lipase from Alcaligenes sp was examined. It was found that the reaction system esterified only 34% after 48 hours of reaction time. The lipase from Alcaligenes sp was estable on detergents and protease system