Purificação da enzima quitosanase de Bacillus cereus em sistemas de duas aquosas

Este trabalho investigou a produção, extração e purificação da enzlma quitosanase. Planejamento fatorial fracionado 25-1 foi utilizado para obtenção de maiores níveis de quitosanase, avaliando o efeito das seguintes variáveis: concentração de quitosana, concentração de sulfato de amônio, pH, aeração e tempo de fermentação. As variáveis significativas para a produção da enzima quitosanase foram a concentração de sulfato de amônio, aeração, pH e as interações entre concentração de sulfato de amônio e aeração. A atividade máxima (l,5U/mL) foi alcançada em meio contendo 2,0% de quito sana, 4,0% de sulfato de amônio, aeração 10 (relação entre o volume do Erlenmeyer e o volume de meio de cultura), pH 5,8, 30°C em 16 horas de fermentação. Purificação primária da enzima quitosanase foi desenvolvida por partição em Sistemas de Duas Fases Aquosas (SDFA). Cinco composições de SDFA foram investigadas, sendo o melhor sistema para separação constituído de 22% PEG 1500 e 10% fosfato. Neste SDFA a enzima quitosanase foi recuperada na fase inferior (91%), obtendo-se um fator de purificação de 5,2. Purificação secundária da enzima quitosanase foi desenvolvida por cromatografia preparativa de troca iônica (CTI) em resina S-Sepharose (catiônica). A extração e purificação nas duas etapas (SDFA e CTI) resultaram em fator de purificação de 20 vezes e 66% de recuperação de quitosanase. Este processo de purificação desenvolvido é potencialmente interessante para a ampliação de escala, alcançando elevada recuperação em apenas duas etapas. A massa molecular da enzima quitosanase purificada (47 kDa) foi determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS) e o ponto isoelétrico (8,8) foi determinado por focalização isoelétricaA culture media for a wild strain of Baci/lus cereus was studied with regard to chitosanase production by means of experimental fractional fatorial design 25-1. The factors which were investigated were the chitosan concentration, the pH, the ammonium sulfate concentration, the aeration and the fennentation time. The factors having the strongest influence on chitosanase production were the ammonium sulfate concentration, aeration, pH and the interaction of the first two parameters. Optimal conditions for chitosan production (1.5 U/rnL) were in culture media containing 2.0% of chitosan, 4.0% of ammonium sulfate and with aeration 10 (Erlenmeyer flask volume and culture media volume ratio) at pH 5.8 at 30° for 16 hours. The enzyme was partially purified by partitioning in aqueous two-phase system (ATPS). Five different ATPS compositions were investigated for enzyme recovery and purity. The best system was made with 22% PEG 1,500, 10% phosphate, where the chitosanase was mainly collected in the botton phase (91% recovery and 5.2 fold the purification factor). A second-step purification was achieved by cation-exchange chromatography with S-Sepharose and salt gradient. The complete two-steps purification process developed achieved 66% chitosanase recovery and a 20 fold increase of the purification factor The apparent molecular weight of the chitosanase detennined by SDS-P AGE electrophoresis was 47 kDa and the observed isoelectric point was 8.