Purificação de lipase de Geotrichum sp. por resina cromatografica de interação hidrofobica : modelagem, simulação e validação de parametros

As lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas com diversas aplicações na indústria farmacêutica, de química fina, óleoquímica e alimentar. Estas enzimas ocorrem em animais e plantas e podem ser produzidas por microrganismos como fungos e bactérias. A recuperação e purifica São destas enzimas para serem utilizadas como biocatalisadores têm sido feita por diferentes métodos, entre eles, a cromatografia. O presente trabalho trata sobre a produção e purificação de lipase do fungo Geotrichum sp. A produção de lipase foi realizada em meio complexo composto por água de maceração de milho (5%), nitrato de amônio (0,5%) e óleo de oliva (1 %), obtendo-se valores elevados de atividade lipolítica em tomo de 20 U/mL. A recuperação da lipase presente no caldo de fermentação foi feita 'com Butyl Sepharose. As condições mais adequadas para a adsorção de lipase na resina hidrofóbica foram concentração de cloreto de sódio 2M e pH 7, sendo a eluição efetuada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7. Estudou-se a cinética de adsorção e foram determinadas as isotermas de adsorção a diferentes concentrações de cloreto de sódio, na faixa de 0,5M a 2M, obtendo-se as constantes cinéticas Qm e k1 através do ajuste dos valores experimentais à equação de Langmuir. Os valores das constantes kl e k2 (kd=k21k1) foram obtidos por ajuste dinâmico utilizando o método de Runge-Kutta de 4a ordem. As constantes cinéticas foram utilizadas para simulação de curvas de ruptura, que foram comparadas com curvas de ruptura experimentais obtidas por injeção do caldo bruto de fermentação contendo diferentes teores de cloreto de sódio, em coluna cromatográfica de Butyl Sepharose montada num FPLC. O grau de ajuste entre as curvas experimentais e as simuladas foi bom. Finalmente, foi realizada a simulação e a otimização do processo CARE ("Continuous Adsorption Recycle Extraction"), utilizando as constantes cinéticas de adsorção da lipase sobre Butyl Sepharose determinadas experimentalmente, obtendo-se faixas de operação que permitem ter rendimento (recuperação da enzima) em torno de 60% e fator de purificação de 14 vezes, mas o fator de concentração é baixo. Estes resultados indicam o potencial de aplicação do processo para purificação de lipaseLipases (EC 3.1.1.3) are a group of enzymes with diverse applications in the phannaceutical, fine chemistry, oil chemistry and food industries. These enzymes occur in animals and plants and can be produced by microorganisms such as fungi and bacteria. The recovery and purificationofthese enzymes for being used as biocatalysts have been carried out by different methods, among them, chromatography. The present work deals with the production and purification of lipase from Geotrichum sp. fungi. The production of lipase was carried out in a complex medium composed of com steep liquor (5%), ammonium nitrate (0,5%) and olive oil (1 %). The values obtained for the lipolytic activity were around 20 U/mL. The recovery of lipase present in the fermentation broth was made using Butyl Sepharose. The best conditions for the lipase adsorption in the hydrophobic resin were a 2M sodium chloride concentration and pH 7, being the elution effected with a 10 mM sodium phosphate buffer at pH 7. Adsorption kinetics was studied and the adsorption isotherms were determined at different sodium chloride concentrations, in the range of 0,5M to 2M. The kinetic constants Qm and kd were obtained by fitting the experimental values to the Langmuir equation. The constant values kl and k2 (kd=k2/kl) were obtained by dynamic fitting using the 4th order Runge-Kutta method. The kinetic constants were used for breakthrough curves simulation, and were compared with experimental breakthrough curves obtained by injection of the fennentation raw broth containing different sodium chloride contents, in a Butyl Sepharose chromatographic column assembled in a FPLC. The degree of the fit between the experimental curves and the simulated ones was good. Finally, the CARE process ("Continuous Adsorption Recycle Extraction") simulation and optimization was carried out using the kinetic constants of lipase adsorption on Butyl Sepharose determined experimentally. Operation ranges obtained allow yields (recovery of the enzyme) around 60% and a high purification factor (14 times), but the concentration factor is low. These results indicate a process application promising potential for lipase purificatio