Evaluation of the effect of ammonium carbamate on the stability of enzymes

A precipitação de proteínas com sais é uma etapa de purificação freqüentemente encontrada em bioprocessos. Porém, a necessidade de um tratamento posterior para recuperação do sal e purificação da proteína torna o processo de precipitação com sais convencionais oneroso, além de limitado por questões ambientais. A precipitação com sais voláteis é uma alternativa à precipitação convencional, tendo como principal vantagem a fácil remoção destes sais dos precipitados e efluentes líquidos através da elevação da temperatura ou diminuição da pressão. A indução do "salting-out" de proteínas por estes sais para foi inicialmente investigada por nosso grupo de pesquisa, no entanto, algumas proteínas apresentaram indícios de desnaturação, embora a eficiência da precipitação tenha sido verificada. Para esclarecer esta questão, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do sal volátil carbamato de amônio na atividade de cinco enzimas (a-amilase, lisozima, celulase, peroxidase e lipase). Realizaram-se ensaios mantendo-se as enzimas a 4,0ºC por 60 min em soluções 1,0 a 5,0 molal deste sal. Depois da remoção do sal volátil, as massas secas foram dissolvidas em tampões apropriados e estas soluções tiveram sua concentração de proteína e atividade enzimática determinadas. Experimentos similares com sais convencionais também foram feitos, assim como ensaios de precipitação com carbamato de amônio em forças iônicas de 5,0 a 9,0 molal. a-Amilase, lisozima e lipase não tiveram perda de atividade em soluções salinas de 1,0 a 5,0 molal, enquanto que celulase e peroxidase mostraram uma perda de atividade média de 55% e 44%, respectivamente. Análises dos experimentos similares com sulfatos de amônio e de sódio levam à conclusão que estas duas enzimas desnaturaram em presença do sal volátil carbamato de amônio. Os ensaios de precipitação não mostraram nenhuma desnaturação enzimática ou separação de fases para a-amilase e lipase, enquanto que a celulase e a peroxidase precipitaram com alguma perda de atividade. Os balanços de massa e de atividade determinados para estes casos não permitiram uma conclusão definitiva sobre o efeito do sal volátil sobre estas duas enzimas durante a precipitaçãoSalting-out is a precipitation method frequently found in downstream processing schemes of proteins. However, the need for post-precipitation treatment for salt recovery and final purification of the protein may lead precipitation with conventional salts to be costly and limited for environmental questions. Precipitation with Volatile salts is an alternative to conventional precipitation, presenting as main advantage the easy salt removal from precipitates and liquid effluents by a temperature increase or a pressure reduction. Protein salting-out induction with these salts was pioneered by our research group. However, there was evidence of some denaturation, although efficient precipitation was verified for all proteins studied. To address this question, the objective of this work was to evaluate the effect of ammonium carbamate volatile salt on the specific activity of five enzymes (an a-amylase, a lysozyme, a cellulase complex, a peroxidase and a lipase). Experiments were made with enzymes kept at 4.0ºC for 60 min in solutions 1.0 to 5.0 molal of this salt. After this salt removal, the dried masses were dissolved in appropriate buffers and these solutions had their protein concentration and enzymatic activity measured. Similar experiments with conventional salts were also carried-out which the desalination made by gel permeation columns as well as precipitation assays with ammonium carbamate at ionic strength from 5.0 to 9.0 molal. a-Amylase, lysozyme and lipase did not undergo activity loss in salt solutions from 1.0 to 5.0 molal, whereas cellulase and peroxidase showed an average activity loss of 55% and 44%, respectively. Analysis of similar experiments with ammonium sulfate and sodium sulfate led to the conclusion that these two enzymes denatured with volatile salt ammonium carbamate. The precipitation assays did not show enzyme denaturation or separation of phases for a -amylase and lipase while celullase and peroxidase precipitated with some activity reduction. Mass and activity balances determined for these cases did not allow a definitive conclusion about the effect of ammonium carbamate on these two enzymes during the precipitatio