Cytogenetic study of Pseudopaludicola canga, P. mineira and P. saltica and five populations of Pseudopaludicola sp. (Anura, Leiuperidae)

O gênero Pseudopaludicola, atualmente pertencente à família Leiuperidae, é formado por 12 espécies amplamente distribuídas pela América do Sul, com nove delas relatadas para o Brasil. Com base em dados morfológicos, as espécies do gênero foram alocadas em dois grupos: "pusilla" e "falcipes". Mudanças taxonômicas freqüentes foram relatadas para o gênero e análises recentes com base em dados moleculares mostraram que as relações intergenéricas de Pseudopaludicola também permanecem pouco esclarecidas. Devido à grande semelhança morfológica dos exemplares de Pseudopaludicola, há suspeita de confusões na identificação das espécies para algumas localidades e da existência de espécies novas. De modo geral, existem poucas informações citogenéticas para o gênero que, em sua maioria, se restringem à determinação do número de cromossomos e análise do cariótipo por método de coloração convencional. Considerando que a análise citogenética mais detalhada constitui uma ferramenta importante que pode contribuir para a diferenciação de espécies de Pseudopaludicola e para o entendimento da sistemática do gênero, no presente trabalho foram estudadas as espécies Pseudopaludicola mineira, P. canga e P. saltica, provenientes de suas localidades-tipo (Serra do Cipó, MG; Serra dos Carajás, PA; e Chapada dos Guimarães, MT, respectivamente), P. saltica de Uberlândia, MG, Pseudopaludicola aff. saltica de Rio Claro (SP), Pseudopaludicola aff. falcipes de Icém (SP), e outras três amostras de Pseudopaludicola sp. (1, 2 e 3) provenientes, respectivamente, de Andaraí (BA), Barreirinhas (MA) e Uberlândia (MG). As metáfases foram obtidas de suspensões de células de epitélio intestinal e de testículo, e coradas com Giemsa ou submetidas às técnicas impregnação por prata (Ag-NOR) para detecção de região organizadora de nucléolo (NOR) e de bandamento C, para a localização de heterocromatina. As espécies estudadas dividem-se em dois grupos quanto ao número de cromossomos, 2n=18 e 2n=22. As espécies P. mineira, Pseudopaludicola sp.1, P. saltica e Pseudopaludicola aff. saltica apresentam 2n=22 cromossomos. Pseudopaludicola mineira diferiu de Pseudopaludicola sp.1 pela morfologia dos pares 7, 8 e 11, posição da NOR no par 8 e pela distribuição de blocos heterocromáticos. As duas populações de P. saltica e a população de Pseudopaludicola aff. saltica apresentaram cromossomos com a mesma morfologia, exceto o par 8 que em P. saltica caracteriza cromossomos sexuais do tipo XX/XY, sendo o X telocêntrico e o Y submetacêntrico, ambos portadores da NOR, enquanto em Psedopaludicola aff. saltica o par 8 é telocêntrico, heteromórfico em tamanho, e apresenta marcação da NOR e banda heterocromática apenas no cromossomo maior do par. Os cariótipos de P. canga, Pseudopaludicola sp.2, Pseudopaludicola sp.3 e Pseudopaludicola aff. falcipes apresentaram cariótipos idênticos com 2n=18 cromossomos. Esses cariótipos diferem, no entanto, quanto à localização da NOR pericentromérica no braço curto do par 3 em P. canga e Pseudopaludicola sp.2 e telomérica no braço longo do par 9 em Pseudopaludicola sp.3 e Pseudopaludicola aff. falcipes. O padrão de bandamento C destas espécies mostrou-se bastante similar diferindo apenas pela presença de uma banda no braço longo do par 2 em P. canga e Pseudopaludicola sp.2 e ausente em Pseudopaludicola sp.3 e Pseudopaludicola aff. falcipes. Os dados citogenéticos permitiram diferenciar Pseudopaludicola sp.1 das demais espécies de 22 cromossomos já cariotipadas, sugerindo que possa se tratar de uma nova espécie. O sistema de determinação do sexo do tipo XX?/XY? detectado em P. saltica não foi relatado anteriormente para o gênero Pseudopaludicola, sendo esse o primeiro caso. A hipótese de fissão seguida de perda do braço menor em um dos homólogos de um par de cromossomos submetacêntricos é sugerida para explicar a origem do cromossomo X. O heteromorfismo do par 8 observado em Pseudopaludicola aff. saltica, pode ter ocorrido por mecanismo de crossing-over desigual. As espécies Pseudopaludicola canga e Pseudopaludicola sp.2 não puderam ser citogeneticamente diferenciadas, no entanto, não descartamos a possibilidade de serem táxons distintos. A grande similaridade dos cariótipos 2n=18 sugere que Pseudopaludicola sp.2, Pseudopaludicola sp.3 e Pseudopaludicola aff. falcipes possam também pertencer ao mesmo grupo em que se encontra P. canga, atualmente grupo "pusilla". Os dados sugerem ainda que Pseudopaludicola aff. falcipes (2n=18) seja proximamente relacionada à P. canga (2n=18) e não a P. falcipes (2n=22), apesar das semelhanças morfológicas entre seus exemplares. Os resultados obtidos no presente estudo reforçam a necessidade de uma extensa revisão taxonômica no gênero PseudopaludicolaThe genus Pseudopaludicola, of the family Leiuperidae, comprises 12 frog species and is widely distributed in South America. In Brazil, nine species have been described within this genus. As based on morphological data, the Pseudopaludicola species were classified in two groups named "pusilla" and "falcipes". Although this genus has undergone several taxonomic changes, recent molecular analyses revealed still unclear intergeneric relationships. The high morphological similarities among diverse species of Pseudopaludicola, associated to their sympatry in several localities, suggest taxonomic misidentification which had been based only in morphological characteristics. Besides, recent studies seem to indicate the existence of cryptic Pseudopaludicola species in several Brazilian localities. Cytogenetics of Pseudopaludicola has been scarce and restricted to the determination of chromosome number and morphology. Further cytogenetic analysis can contribute to differentiate the Pseudopaludicola species and, therefore, improve the sistematics of this genus. The objective of this work was to analyze the karyotypes of several Brazilian Pseudopaludicola species aiming at providing their characterization and further understanding of their systematic relationships. The analyzed species were the P. mineira, P. canga and P. saltica, from their type-localities (Serra do Cipó, MG; Serra dos Carajás, PA, and Chapada dos Guimarães, MT, respectively), P. saltica from Uberlândia, MG, Pseudopaludicola aff. saltica from Rio Claro (SP), Pseudopaludicola aff. falcipes from Icém (SP), and specimens of Pseudopaludicola sp. 1, 2 and 3, respectively from Andaraí (BA), Barreirinhas (MA) and Uberlândia (MG). Metaphases were obtained from intestinal epithelium and testicular cell suspensions, and stained with Giemsa or submitted to silver staining, in order to detect the nucleolus organizing regions (Ag-NOR), and to C-banding technique for heterochromatin localization. As based on chromosome number, there were two groups of karyotypes, with 2n=22 and 2n=18. The species P. mineira, Pseudopaludicola sp.1, P. saltica and Pseudopaludicola aff. saltica had a diploid number of 2n=22. Pseudopaludicola mineira and Pseudopaludicola sp.1 differed in the morphology of pairs 7, 8 and 11, in the NOR location in the pair 8 and in the heterochromatin distribution. The P. saltica and Pseudopaludicola aff. saltica populations showed very similar chromosomal morphology and identical heterochromatin pattern, except for the pair 8. In P. saltica, the pair 8 was characterized as sex chromosomes XX?/XY?, being the X classified as telocentric and Y submetacentric, whereas in Psedopaludicola aff. saltica, in both male and female specimens, the homologues of pair 8 are telocentrics, heteromorphic in size with the heterochromatin block present only in the longer homologue. The pair 8 is the NOR-bearing chromosome in both P. saltica and Psedopaludicola aff. saltica. High similarity was observed among the karyotypes of P. canga, Pseudopaludicola sp.2, Pseudopaludicola sp.3 and Pseudopaludicola aff. falcipes, all of them with 2n=18 chromosomes. However, these karyotypes differed in the NOR location, which was on pair 3 in P. canga and Pseudopaludicola sp.2, and on pair 9 in Pseudopaludicola sp.3 and Pseudopaludicola aff. falcipes. These species had similar heterochromatic blocks, except for one C-band on the long arm of pair 2 in P. canga and Pseudopaludicola sp.2, which was not observed in Pseudopaludicola sp.3 e Pseudopaludicola aff. falcipes). The cytogenetic data clearly distinguished Pseudopaludicola sp.1 from the other known species of this genus with 22 chromosomes, and suggested that this could be a not yet described species. The identification of sex chromosomes XX?/XY? in P. saltica, is the first case of sex chromosomes reported in the genus Pseudopaludicola. A mechanism of fission followed by loss of the short arm in one of homologues of a submetacentric pair could explain the origin of the X chromosome in P. saltica. The size heteromorphism in the homologues of the pair 8 of Pseudopaludicola aff. saltica, with the NOR site and heterochromatin present only in one of the homologues, could be explained by unequal crossing-over. The species Pseudopaludicola canga and Pseudopaludicola sp.2 could not be cytogenetically distinguished, suggesting that they belong to the same taxon. Since all the analyzed karyotypes of 2n=18 were very similar, we may suggest that Pseudopaludicola sp.2, Pseudopaludicola sp.3 e Pseudopaludicola aff. falcipes should be included in the same group of P. canga, which is currently allocated in the "pusilla" group. In addition, the results indicated that Pseudopaludicola aff. falcipes (2n=18) is more closely related to P. canga (2n=18) than to P. falcipes (2n=22), although the specimens are morphologically very similar and their identification is not unequivocal. Ultimately, the data presented herein reinforce the necessity of a taxonomic revision of the genus Pseudopaludicol