Identification and characterization of proteins expressed in the intercellular space of leves from Theobroma cacao infected by Moniliophthora perniciosa

A invasão do apoplasto é uma fase crítica na infecção de numerosos patógenos, incluindo o fungo M. perniciosa (Mp), que permanece na fase parasítica neste espaço por um período que pode chegar a 60 dias. Então, o entendimento da natureza das defesas da planta no apoplasto e dos mecanismos de resposta que os patógenos acionam para sobrepor estas defesas, é essencial para um compreensivo entendimento da interação potógeno-hospedeiro. Nesse trabalho, para estabelecer um procedimento de rotina para a aplicação de análises bioquímicas e proteômicas de tecidos de cacau, três novos protocolos foram estabelecidos: um para extração de fluido apoplástico (FA) e dois para extração de proteínas, sob condições nativas e desnaturantes. O FA das variedades de cacau TSH1188 (resistente) e Catongo (susceptível), foi analisado quanto ao efeito inibitório sobre a germinação de basidiósporos do fungo e quanto à atividade das enzimas quitinase, glucanase e peroxidase. Também foi analisado o perfil protéico em 2-DE para o fluido apoplástico de TSH1188 sadio e infectado. Quatro cistatinas, inibidores de cisteíno proteases, identificadas em bibliotecas de cDNA da interação T. cacao-Mp foram caracterizadas. O primeiro método descrito permite a extração de FA, usando infiltração a vácuo e centrifugação. A composição desse fluido é representativa da folha intacta, conforme baixa contaminação citoplasmática, detectado com o uso de hexose fosfato isomerase como marcador. A extração de proteínas sob condições desnaturantes para 2-DE foi implementada por um processo incluindo fenol, tampão SDS-denso e passos de sonicação. Com este protocolo, proteínas de folhas e meristemas foram isoladas e mostraram boa resolução em 1-DE e 2-DE. A extração de proteínas ativas para a detecção de atividade enzimática foi desenvolvida com sonicação associada à precipitação de polissacarídeos com tert-butanol. A análise do FA revelou um padrão de atividade enzimática e um perfil eletroforético em 2-DE, que juntamente com os efeitos inibitórios do FA, indicam que durante a fase inicial da interação T. cacao-Mp, importantes mecanismos de defesa são ativados no apoplasto de TSH1188 e reprimidos em Catongo. A indução da atividade de peroxidase no terceiro dia após a inoculação de TSH1188, conjuntamente, com dados da literatura, reforça a hipótese de ocorrência de “explosão” oxidativa no início da interação. Esses dados sugerem que o teste de germinação de basidiósporos no FA tem potencial para a seleção de genótipos de cacau resistentes ao fungo M. perniciosa, mas o estado fito-sanitário da planta deve ser considerado anteriormente ao teste. Os cDNAs de cistatinas do cacau, denominados TcCYS1, TcCYS2, TcCYS3 e TcCYS4, codificam proteínas com 209, 127, 124 e 205 aminoácidos, respectivamente. As proteínas recombinantes expressas em E. coli mostraram atividade inibitória contra o fungo Mp. TcCYS3 e TcCYS4 imobilizadas em sefarose capturaram proteases do sobrenadante de cultura de Mp. As constantes de inibição (Ki) para papaína com o substrato BApNA foram 203.2, 220.7, 152.4 e 158.9, respectivamente. Anticorpos policlonais contra TcCYS4 detectaram a proteína com mais abundância em tecidos jovens. O anti-TcCYS4 também identificou uma multicistatina de 85 kDa induzida por Mp, MpNEP e sobrenadante de cultura de Mp.The invasion of the plant apoplast is a critical phase of the infection for numerous pathogens, including the fungus M. perniciosa (Mp) that remains in the intercellular space at the parasitic stage until about 60 days. Thus, the understanding of plant defenses induced in the apoplasm and the response mechanisms that the pathogens used for bypassing these defenses is essential to explain the plant-pathogen interaction. To establish a routine procedure for proteomic and biochemical analysis of cacao tissues, three new protocols were developed: one for apoplastic washing fluid (AWF) extraction, and two for protein extraction – under denaturing and non-denaturing conditions. The inhibitory effect of AWF from resistant cacao (TSH1188) and susceptible one (Catongo) on fungus basidiospores was analyzed, as well as chitinase, glucanase and peroxidase enzyme activities. The 2-DE of AWF protein profiles of healthy and infected TSH1188 were analyzed. Four cystatins, cysteine protease inhibitors, identified in cDNA library from T. cacao-Mp interaction were characterized. The first described method allows a quick and easy collection of AWF – using infiltration –centrifugation procedure – that is representative of its composition in intact leaves according to the little symplastic contamination detected by the use of the hexose phosphate isomerase marker. Protein extraction under denaturing conditions for 2-DE was remarkably improved by the combination of chemically and physically modified processes including phenol, SDS dense buffer and sonication steps. With this protocol, high-quality proteins from cacao leaves and meristems were isolated, and for the first time well-resolved 1-DE and 2-DE protein patterns of cacao vegetative organs are shown. It also appears that sonication associated with polysaccharide precipitation using tert-butanol was a crucial step for the non-denaturing protein extraction and subsequent enzymatic activity detection. AWF analyses revealed an enzymatic activity level and 2-DE profile that together with the inhibitory effect of AWF, suggest that during the initial stage of the T. cacao-Mp interaction, important mechanisms of defense are activated in the TSH1188 apoplast and repressed in Catongo. The peroxidase activity induction three days after TSH1188 inoculation, associated with literature information, reinforces the hypothesis of occurrence of an oxidative burst in the early stage of the interaction. These data suggest that the basidiospore germination test in AWF may be used for selection of cacao genotypes resistant to Mp, but the phyto-sanitary conditions of plants should be considered previously to the test. Cacao cystatin cDNA named TcCYS1, TcCYS2, TcCYS3 and TcCYS4 encode proteins with 209, 127, 124 and 205 amino acid residues, respectively. The corresponding His-tagged recombinant proteins were expressed in E. coli and showed inhibitory activity against Mp. TcCYS3 and TcCYS4-CNBr-sepharose immobilized captured proteases from Mp culture media. The Ki for papain with the colorimetric substrate BApNA was 203.2, 220.7, 152.4 and 158.9 for recombinant TcCYS1, 2, 3 and 4, respectively. Polyclonal antibodies raised against the recombinant TcCYS4 detected an endogenous protein more abundant in young tissues comparatively with mature tissues from cacao. A ~85 kDa cacao multicystatin induced by Mp inoculation, MpNEP (necrosis and ethylene-inducing proteins) and Mp culture supernatant infiltration was detected by anti-TcCYS4 antibodies in cacao meristems