Estudo da viabilidade de enxertos de nervos mantidos em soluções conservadoras

As lesões traumáticas incidem com grande freqüência sobre o sistema nervoso periférico, apresentando prognóstico reservado principalmente quando ocorre transecção completa do nervo. Todavia, com o melhor conhecimento dos fenômenos celulares e moleculares envolvidos na regeneração axonal e das técnicas microcirúrgicas, tem-se buscado melhorar esse quadro. Neste sentido, tem sido objeto de investigação nos últimos anos a criação de um banco de nervos que viria facilitar o reparo de lesões nervosas com extensa perda de substância. Assim, diversos métodos vem sendo testados para a conservação dos segmentos de nervos para posterior transplante. Neste estudo foram analisados os aspectos morfológicos e quantitativos de enxertos autólogos previamente mantidos em dois tipos de solução conservadora. Foram utilizados quarenta ratos machos da linhagem Wistar, sendo que 16 deles foram subdivididos em grupos de 4 animais, que tiveram os nervos tibial esquerdo e direito removidos e mantidos em solução conservadora de Wisconsin/Belzer (4°C), por 24 ou 72 horas, ou em solução conservadora de Collins (4°C), por 24 ou 72 horas, respectivamente. Após os períodos de conservação previstos, estes nervos foram processados para análise histológica, conforme descrito a seguir. Outros 4 animais, controles, tiveram os nervos tibial direito e esquerdo removidos e imediatamente processados para histologia. Por sua vez, um grupo de 15 animais teve o nervo tibial esquerdo removido e conservado por 24 horas ou 72 horas em solução de Wisconsin/Belzer (4°C) ou solução de Collins (4°C), e posteriormente transplantado no mesmo animal para o lado direito. Outros' 5 animais, tiveram o nervo tibial esquerdo retirado e imediatamente transplantado para o lado direito. A conduta cirúrgica foi precedida sempre de anestesia profunda com pentobarbital sódico (50mg/Kg/peso) para todos os animais. Após 50 dias do transplante, os animais que receberam os enxertos nervosos foram anestesiados para exposição do respectivo enxerto e para sua fixação "in situ" com uma solução de glutaraldeído 2% e formaldeído 1 %, em tampão fosfato de sódio 0,1 M. Após serem mantidos por 24 horas nesta solução, os segmentos do enxerto foram pós-fixados em OS04 e incluídos em resina. A seguir, de cada' espécime foram obtidos cortes semi-finos da porção média do enxerto, os quais foram corados com azul de Toluidina e analisados em microscópio de luz convencional. Para a análise quantitativa dos axônios regenerados no enxerto, foram amostrados cinco campos diferentes e fotografados sob objetiva de imersão (100x). Os negativos foram copiados em papel fotográfico com o aumento final de 1625 vezes e procedeu-se a contagem dos axônios mielínicos com o auxílio de contador eletrônico. A análise histológica mostrou que a regeneração axonal, após 50 dias do transplante, estava mais avançada nos enxertos previamente mantidos nas solução de Wisconsin/Belzer, em relação aos enxertos mantidos na solução de Collins, e era semelhante à observada nos enxertos frescos. A análise da densidade de axônios mielínicos regenerados nas diferentes condições experimentais confirmou os resultados histológicos. Assim, o número de axônios mielínicos regenerados em 104µm2 de área nos enxertos previamente mantidos em solução Wisconsin/Belzer, por 24 ou 72 horas, foram, respectivamente, 433±12 e 430±32. Sendo estes resultados significamente superiores aos observados nos enxertos mantidos em solução de Collins por 24 horas (344±20b) e 72 horas (327±29 b) e semelhante aos computados nos enxertos frescos (407±1±13a). Estes resultados mostraram que a composição da solução conservadora de Wisconsin/Belzer é capaz de manter a viabilidade dos enxertos de nervos, nos períodos de tempo estudados, de maneira superior à da solução de Collins, podendo ser proposta como um meio adequado para a preservação dos nervos até o seu transplanteTraumatic lesions are very often on peripheral nervous system, and have reserved prognostic when a loss important nerve segment occurs. However, the knowledge about the cellular and the molecular events promoting the nerve regeneration, besides the use of microsurgical techniques, gives a better perceptive to improve the peripheral nerve repair nowadays. In this scenario, several assays were done to develop a nerve bank that would be used for surgery when a graft is necessary to repair a nerve gap. In this study we investigate the morphological and quantitative aspects of the nerve regeneration across autologous nerve grafts previously stored in two types of preserve solutions. Forty Wistar male rats were used and 16 of them had the left and right tibial nerves removed and stored during 24 or 72 hours in Wisconsin/Belzer solution or in Collins solution (4°C). Following previous stórage period those nerves are processed for histology. Other 4 animals had the left and the right tibial nerve removed and immediately processed for histology. A group of 15 animals had the left tibial nerve removed and stored during 24 and 72 hours in Wisconsin/Belzer solution or in Collins solution and subsequently transplanted in the right side. Other 5 animals had the left tibial nerve removed and immediately transplanted to the right side. After 50 days of the transplant, the animals were reoperated to remove the nerve graft. It was exposed, dissected, fixed "in situ" using a fixative solution (2% paraformaldehyde, 1 % glutaraldehyde, in PBS 0,1 M, pH 7,4) and removed. Following, the nerve graft was postfixed in OS04 and embedded in resin. Semi-thin (1,0 µm) cross sections of the middle region of the nerve graft were obtained, stained in toluidine blue and observed in light microscopy. To perform the quantitative analysis the cross section of the graft was sampled in 5 different fields and the density of mielinated nerve fibers on 1 0 m2 was computed using an electronic counter. The morphological analysis shows that the structure of the nerve was well preserved after 24 or 72 hours storage in Wisconsin/Belzer or Collins solutions. The nerve fiber regeneration, 50 days after the' graft transplantation, was more advanced in the grafts previously stored in Wisconsin/Belzer solution related to the graft stored in Collins solution, and similar to the observed in fresh nerve graft. The quantitative data confirm these morphological results. The nerve fibers density in nerve graft previously stored during 24 or 72 hours in Wisconsin/Belzer solution was significantly (p