Structure and evolution of the mitochondrial genome in family Muscidae (Diptera: Calyptratae)

o DNA mitocondrial (DNAmt) dos metazoários possui uma série de características, tais como organização circular, simples e compacta, conteúdo gênico conservado, herança predominantemente materna e ausência ou baixa taxa de eventos de recombinação, que fazem com que este genoma seja amplamente usado em diversos estudos evolutivos. Geralmente, o DNAmt animal possui 37 genes (13 codificadores de proteínas, 22 para RNAt e 2 para RNAr) e uma principal região não-codificadora, a região-controle. O objetivo do projeto foi o seqüenciamento e a caracterização estrutural e evolutiva de regiões gênicas e do genoma mitocondrial de espécies da família Muscidae (Diptera: Calyptratae), incluindo a mosca-dos chifres, Haematobia irritans, a mosca doméstica, Mosca domestica, a mosca menor das frutas, Atherigona orientalis, "the black dump fly", Ophyra aenescens, e a mosca-dos-estábulos, Stomoxys calcitrans. A estrutura da tese foi dividida em quatro capítulos. No primeiro capítulo, a seqüência completa do gene da subunidade I da cito cromo oxidase c (COI) foi caracterizada. COI é o gene mais seqüenciado entre os insetos e tem sido usado em diversos estudos evolutivos e taxonômicos. Este gene mostrou-se estruturalmente semelhante aos demais dípteros, incluindo o uso de um códon de iniciação não usual, TCG (serina). O segundo capítulo descreve um novo conjunto de oligonucleotídeos iniciadores que ajudou a amplificar e seqüenciar regiões do DNAmt de vários dípteros onde há alta chance de ocorrer rearranjos e/ou duplicações (regiões de "hot spots" ou "instabilidade estrutural" no DNAmt de artrópodes, que incluem a região-controle e agrupamentos de RNAt). O terceiro capítulo descreve a seqüência completa da região-controle de H. irritans, M domestica e A. orientalis, define padrões evolutivo-estruturais para moscas da subordem Brachycera e sugere a atuação de elementos cis-regulatórios no controle da replicação e transcrição do DNAmt de insetos. Ao tentar acessar a região-controle de O. aenescens e S. calcitrans, foi evidenciado um possível evento de rearranjo e/ou duplicação no genoma mitocondrial destas espécies envolvendo os genes que flanqueiam a região-controle. O quarto capítulo descreve uma análise comparativa entre os genomas mitocondriais de H. irritans (16078bp) e S. calcitrans (18Kb). Um conjunto de estratégias, incluindo amplificação via LongPCR, construção de bibliotecas de "shotgun", montagem, anotação e análises estruturais utilizando recursos de bioinformática, foi otimizada durante este trabalho. Os genomas mitocondriais de H. irritans e S. calcitrans possuem conteúdo e organização gênicos conservados, considerando-se o modelo ancestral proposto para artrópodes, exceto pela regiãocontrole de S. calcitrans (2,5Kb), que teve 60% de sua seqüência caracterizada, suficientes para indicar a ocorrência de duplicação gênica envolvendo elementos internos da região-controle e o gene de RNAt para isoleucina (I). A duplicação de 1 no DNAmt de S. calcitrans é muito semelhante a que ocorre no DNAmt de espécies de Chrysomya (Diptera: Calliphoridae), reforçando que esta região é um "hot spot" de duplicação no genoma mitocondrial de dípteros. Uma árvore filogenética usando os genes codificadores de proteínas foi inferida para a ordem Diptera e o resultado difere da filogenia tradicional proposta para o grupoThe mitochondrial DNA (mtDNA) of Metazoan has features, such as circular, simple and compact organization, conserved gene content, predominantly maternal inheritance, and lack or low rate of recombination, which have made this genome widely used in a range of evolutionary studies. In general, animal mtDNA presents 37 genes (13 protein-coding genes, 22 genes for tRNA and 2 for rRNA) and a major non-coding region, the control region. The aim ofthis project was the sequencing and the structural and evolutionary characterization of gene regions and the mitochondrial genome of species from family Muscidae (Diptera: Calyptratae): the horn fly, Haematobia irritans; the house fly, Musca domestica; the pepper fruitfly, Atherigona orientalis; the black dump fly, Ophyra aenescens; and the stable fly, Stomoxys calcitrans. The structure of the thesis was divided in four chapters. In the first chapter, the complete sequence of the cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene was characterized. COI is the most sequenced gene in insects and have been used in a wide range of evolutionary and taxonomic studies. This gene in Muscidae showed a structure similar to other dipterans, including the use of an uncommon start codon, TCG (serine). The second chapter describes a new set of primers that improved the amplification and sequencing of regions from many dipterans mtDNA in which there is a high probability of rearrangements andlor duplications occur (regions involved in structural "hot spots", including the control region and tRNA clusters). The third chapter describes the complete sequence of H. irritans, M domestica and A. orientalis, defines evolutionary and structural patterns for Brachyceran flies and suggests cis-regulatory elements for the mtDNA repÍication and transcription control in insects. Trying to access the control region of O. aenescens and S. calcitrans, a possible event of rearrangement andlor duplication in the mitochondrial genome of these species was evidenced involving the control region flanking genes. The fourth chapter describes a comparative analysis of H. irritans (l6078bp) and S. calcitrans (-18Kb) mitochondrial genomes. A set of strategies, including the amplification via Long-PCR, construction of a shotgun library, assemblage, annotation and structural analysis using bioinformatic tools, was optimized in this work. The mitochondrial genomes of H. irritans and S. calcitrans showed gene content and organization conserved regarding the ancestral model proposed to arthropods, except for S. calcitrans control region (-2.5Kb), which had 60% of its sequence characterized. This characterization indicated the occurrence of duplicated regions involving control region nternal elements and the tRNAgene for isoleucine (I). The duplication of 1 is very similar to that of Chrysomya (Diptera: Calliphoridae) mtDNA, reinforcing that this region is a duplication hot spot in the mitochondrial genome of dipterans. A phylogenetic tree using the protein-coding genes was inferred for the Diptera order and the results differ from the traditional phylogeny proposed for the grou