Mecanismo de ação de fosfolipases A2 secretadas na reação inflamatoria aguda

Bothropstoxina-I (BthTX-I) e Bothropstoxina-II (BthTX-II) são sPLAzs homólogas com atividade miotóxica isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. A primeira é completamente destituída de atividade enzimática in vitro ao passo que a BthTX-II apresenta atividade fosfolipásica muito baixa. Piratoxina-I (prTX-I) é uma sPLAz homóloga com atividade miotóxica isolada do veneno de Bothrops pirajai. Esta sPLAz também é destituída de atividade enzimática. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade edematogênica da PrTX-I em pata e pele de ratos. Também avaliamos a participação do sítio catalítico e do conteúdo de cargas catiônicas presentes nesta sPLAz sobre o aumento de permeabilidade vascular. Em uma segunda etapa, o objetivo foi investigar a capacidade da PrTX-I, BthTX-I e BthTX-II de induzir migração leucocitária comparado com a sPLAz do veneno de Naja naja (atividade enzimática alta) e sPLAz pancreática (atividade enzimática intermediária). O envolvimento de mastócitos na migração leucocitária induzida pelas sPLAz homólogas também foi investigado. O edema de pata foi induzido pela injeção subplantar da PrTX-I na pata posterior esquerda dos animais e o volume da pata foi determinado utilizando um hidropletismômetro. O edema de pele foi determinado pelo acúmulo local de albumina humana marcada com lZ51 administrada por via intravenosa em ratos anestesiados (Sagatal; 30 mglkg,ip.). A degranulação de mastócitos pleurais e peritoneais foi conduzida pela determinação da liberação de [14C]5-HT utilizando um contador. A migração leucocitária foi determinada através da injeção das sPLAzs na cavidade pleural de ratos anestesiados com éter. Os animais foram sacrificados nos intervalos de 6, 12 e 48 h e a cavidade pleural foi lavada com 5 ml de PBS heparinizado (10 UI/ml). A contagem total e diferencial de leucócitos foi avaliada no lavado pleural A PrTX-I promoveu aumento de permeabilidade vascular em pele e pata de rato levando à formação de edema. A atividade edematogênica nos dois locais foi praticamente abolida nos animais pré-tratados com ciproheptadina (2 mglkg, i.p. 0.5 h antes). O p-BPB reduziu acentuadamente o edema induzido pela PrTX-I em pata e pele de ratos. O poliânion heparina reduziu significativamente o edema de pata (50 UI/pata), como também o edema de pele (5 UI/sítio) induzidos pela PrTX-I. Além disso, a PrTX-I (100 Ilglml) causou degranulação de mastócitos pleurais e peritoneais in vitro. O p-BPB e a heparina (50 UI/ml) inibiram significativamente a liberação de [14C]5-HT induzida pela PrTX-I em mastócitos pleurais e peritoneais de rato. Nossos resultados indicam que a formação de edema induzido pela PrTX-I é devido à degranulação in vivo de mastócitos. Uma vez que a PrTX-I não é ativa enzimaticamente sugerimos que a atividade pró-inflamatória das sPLA2s não está, necessariamente, ligada à atividade enzimática destas enzimas. Assim, sugerimos que o efeito da PrTX-I deva ser decorrente de um possível sítio farmacológico que seria formado principalmente por cargas catiônicas distribuídas na molécula da PrTX-I. Além disso, nós sugerimos cautela quanto ao uso do brometo de p-bromofenacil como ferramenta para avaliar o papel da atividade enzimática nos efeitos farmacológicos induzidos pelas sPLA2s. A sPLA2 de Naja naja (10 J.1g/cavidade) e BthTX-II (30 J.1g/cavidade) induziram influxo leucocitário de forma dose e tempo-dependentes caracterizado pela infiltração de neutrófilos e células mononucleares em 6 h. Na pleurisia induzida pela sPLA2 de Naja naja esta migração foi acompanhada por uma migração de eosinófilos em 12 h. Na pleurisia induzida pela BthTX-I e PrTX I (30 J.1g/cavidade cada) o pico de infiltração celular foi em 12 h e formado, tanto por células mononucleares e neutrófilos, como também por eosinófilos. O brometo de p-bromofenacil (P-BPB), um inbidor enzimático das sPLA2s, aboliu a atividade enzimática da sPLA2 de Naja naja e BthTX-II mas não apresentou efeito na pleurisia induzida pela sPLA2 de Naja naja, BthTX-I e Bth'FX-U. Surpreendentemente, o p-BPB reduziu parcialmente a pleurisia induzida pela PrTX-I. O tratamento prévio dos ~mais com ciproheptadina (10 mg/Kg, i.p.) não modificou a pleurisia induzida pela sPLA2 de Naja naja e BthTX-II. A depleção dos estoques de histaminalS-HT por injeções repetidas do composto 48/80 também não alterou a pleurisiã induzida pelas BthTXs e PrTX-I. ossos resultados demonstram que a migração leucocitária induzida pela sPLA2 de Naja naja, Bt}},TX-I, BthTX-II e PrTX-I independe da degranulação de mastócitos pleurais. Além disso, a hidrólise de fosfolipídeos por estas sPLA2s não é essencial para a infiltração leucocitária para cavidade pleuralBothropstoxin I (BthTX-I) and Bothropstoxin 11 (BthTX-II) are sPLAzs homologues with myotoxic activity isolated ITom Bothrops jararacussu venom. The former is devoided of enzymatic activity in egg yolk lecithin whereas the latter has low phospholipase activity in this substrate. Piratoxin-I (PrTX-I) is a PLAz homologue with myotoxic activity isolated ITom Bothrops pirajai venom. This sPLAz is also devoided of enzymatic activity. The aim of this study was to investigate the ability of PrTX-I, BthTX-I and BthTX-II to induce leucocyte migration compared with Naja naja PLAz (known to contain high enzymatic activity) and bovine pancreatic PLAz (known to contain intermediate enzymatic activity). We have also investigate the role of mast cells in the leucocyte migration induced by PrTX-I, BthTX-I and BthTX-II. Leucocyte migration was determined through of the injection of sPLAzs into the pleural cavity of male Wistar rats under ether anaesthesia. The animals were killed at 6, 12 and 48 h later and the pleural cavity rinsed with 5 rnl of PBS containing heparin (20 IU/rnl). Total and differencial leucocyte counts were evaluated in the pleural exudate. Naja naja PLAz (10 ~g/cavity) and BthTX-II (30 ~g/cavity) induced a dose- and time dependent rat pleural leucocyte influx characterized by an early neutrophil and mononuclear cells infiltration (6 h). This migration was followed by a late eosinophil and mononuclear cells influx (12 h) in the Naja naja PLAz- induced pleurisy. BthTX-I and PrTX-I (30 ~g/cavity each) induced dose and time-dependent rat pleural leucocyte influx characterized by an infiltration of neutrophils, eosinophils and mononuclear cells at 12 h. p-Bromophenacyl bromide (P-BPB), a compound known to inhibit phospholipase Az activity, abolished the enzymatic activity of Naja naja PLAz and BthTX11 but it had no effect on the pleurisy induced by Naja naja PLAz, BthTX-I and BthTX-II. Interestingly, p-bromophenacyl partially reduced the PrTX=:I-fuduced pleurisy. Previous treatment of the animals with cyproheptadine (10 mg/kg, i.p.) did not affect the pleurisy induced by Naja naja PLAz and BthTX-II. The depletion ofhistamine and 5-HT stores by repeated injections of compound 48/80 also failed to modify the pleurisy induced by BthTXs and PrTX-1. Qur results demonstrate that pleurisy mediated by Naja naja PLAz, BthTX-I, BthTX-II and PrTX-I is not dependent on pleural mast cell degranulation. Furthermore, hydrolysis of phospholipids by these sPLAzs is not essencial for the pleuralleucocyte infiltration. In the second part of this study the aim was to investigate the ability of PrTX-I to induce local oedema formation in both rat paw and skin in vivo. The importance of their catalytic and cationic sites were evaluated using p-BPB and heparin, respectively. Male Wistar rats were used. Paw oedema was induced by a subplantar injection of PrTX-I into the left hind-paw of animals and paw volume was measured using a hydroplethysmometer. Skin oedema formation was measured as the local accumulation of i.v. injected C25I]-human serum albumin into the skin sites of anaesthetized rats (Sagatal; 30 mglkg, i.p.). In vitro pleural and peritoneal mast cells degranulation was carried out by measuring the released [14C]5-HT using a f3 counter. PrTX-I caused dose-dependent rat paw and skin oedema. These oedematogenic activity were largely reduced in animals pretreated with cyproheptadine (2 mg/Kg, Lp. 0.5 h before). Similarly, pBPB significantly inhibited rat paw and skin oedema induced by PrTX-I. The polyanion heparin significantly reduced the paw oedema (50 IU/paw) as well as the skin oedema (5 IU/site) induced by PrTX-I. In addition, PrTX-I (100 Jlglrnl) caused in vitro pleural and peritoneal mast cells degranulation. p-BPB and heparin (50 IU/rnl) significantly inhibited the C4C]5-HT release induced by PrTX-I in both pleural and peritoneal mast cells. Our results indicate that oedema formation induced by PrTX-I is mostly dependent on in vivo mast cell degranulation. Since heparin reduced the oedematogenic activity of this sPLA2 homologue, it is likely that the cationic charge of this substance plays a role in the mast cell activation. Our results also indicate that p-bromophenacyl bromide may not be a suitable pharmacological tool to investigate th~ correlation between enzymatic activity and the inflammatory effects of phospholipases A