Aspectos estruturais, funcionais e conformacionais do inibidor de tripsina CTI de sementes de Copaifera Iangsdorffii

As técnicas utilizadas no esclarecimento de estruturas macromoleculares estão situadas em campos interdisciplinares, onde os pesquisadores encontram-se unidos por um interesse comum, no sentido de detalhar o entendimento da função biológica e a relação com sua estrutura primária e tridimensional. Os inibidores de sementes de leguminosas são encontrados sob várias isoformas. Alguns métodos, como a espectrometria de massas, determinação da seqüência Nterminal e eletroforese bidimensional, vêm sendo amplamente explorados com o propósito de caracterizar melhor as isoformas presentes em sementes. A eletroforese bidimensional do inibidor de tripsina de Copaíba (CTI) revelou a presença de vários spots na faixa de 11 e 9 kDa. CTI foi resolvido em dois picos (CTI-I e CTI-II) quando submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18 em sistema HPLC. Esses picos distintos foram submetidos à eletroforese bidimensional sendo três spots observados para CTI-I com pl de 8.0, 8.5 e 9.0 e três spots para CTI-II com pl de 4.7, 4.6 e 4.3. A análise por espectrometria de massa foi realizada para as subunidades CTI-I e CTI-II objetivando determinar as massas moleculares acuradas e prováveis números de isoformas para cada subunidade. Os espectros confirmaram uma heterogeneidade para CTI-I e CTI-II com predominância dos picos de massa 10.719 e 8.244, respectivamente. A impossibilidade em seqüenciar todos os spots para cada subunidade de CTI, norteou a escolha dos spots A e F de forma continuar os estudos de sequenciamento. Os spots A e F foram submetidos a digestões enzimáticas com as proteases tripsina, SV8 e clostripaína. A massa exata dos peptídeos de cada digesto foi determinada por espectrometria de massas utilizando MALDI- TOF. Os peptídeos mais intensos foram purificados e seqüenciados em um HPLC capilar acoplado ao espectrômetro de massas ESI QTOF. A estrutura primária final de CTI, determinada a partir da massa dos peptídeos das digestões enzimáticas e da seqüência obtida por espectrometria de massas indicou 182 resíduos de aminoácidos, apresentando elevado grau de homologia em relação a outros inibidores de tripsina do tipo Kunitz de vegetais; inclusive com o resíduo de arginina na posição do sítio reativo. A estrutura cristalográfica CTI foi resolvida, revelando que este inibidor é composto por duas cadeias polipeptídicas não covalentemente ligadas e possui apenas uma ponte dissulfeto. t de as diferenças estruturais, CTI é um inibidor efetivo de tripsina com uma constante de dissociação de 1,2 nM, da mesma ordem de grandeza que os inibidores padrões como STI, ETI ou WCI. Sua estrutura tridimensional revela que isso se deve ao fato de que as discrepâncias estruturais não afetam a conformação canônica do seu loop reativo. A comparação entre a seqüência deduzida dos mapas experimentais da densidade eletrônica e a seqüência determinada por 2D-PAGE e espectrometria de massas MALDI-TOF e ESI-QTOF, mostra um acordo de aproximadamente 75%, que pode ser devido à presença de várias isoformas que é um aspecto comum das proteínas extraídas de sementes. Experimentos objetivando a determinação dos residuos de aminoácidos importantes na atividade inibitória de CTI foram realizados utilizando reagentes modificadores específicos. O inibidor CTI foi inativado em 48 e 81% por EDC e PGO, respectivamente. Esses compostos atuam em grupos carboxila de Asp e Glu (EDC) e resíduos de arginina (PGO) , indicando funcionalmente a importância do resíduo de arginina na interação do inibidor com a protease. Estudos da estabilidade conformacional em diferentes pHs, temperaturas e agentes caotrópicos fomecem importantes informações sobre a biogênese e estrutura das proteínas. Um estudo verificando o efeito de agentes físico-químicos (pH, temperatura, DTT, uréia e cIoreto de guanidina) na estabilidade conformacional do inibidor de tripsina (CTI) purificado de sementes de Copaifera langsdorffii foi realizado. CTI, um inibidor atípico da família Kunitz, demonstrou ser resistente em sua estabilidade funcional, apesar de sofrer prejuízos na estrutura quatemária após redução em 1 mM DTT como evidenciado por SDS-PAGE, gel filtração em protein-pack, experimentos cinéticos, espectros de fluorescência e de dicroísmo circular. Os experimentos de desnaturação em função dos agentes caotrópicos foram monitorados pela intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. A desnaturação de CTI na presença de agentes caotrópicos mostrou ser um processo reversível após diálise, para estrutura e função no caso da uréia e do cloreto de guanidina. Os resultados indicaram que a desnaturação de CTI envolve pelo menos dois estágios: nativo e desnaturado. A presença de 3.5 M de uréia ou GdnHCI inibiu 50% e 100% da atividade inibitória, respectivamente. Ambos agentes caotrópicos promoveram um deslocamento do centro de massa. O cálculo da estabilidade conformacional AG (H20) foi feito tomando-se o deslocamento nos comprimentos de onda máxima de emissão de fluorescência como parâmetro. O AG (H2O) em função da concentração de uréia e guanidina foi de 63.0 e 54.0 Kcal mol-1, respectivamente. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casosThe techniques used in the clarification of macromolecular structures are situated in interdisciplinary fields, where the researchers find themselves united by a common interest in detailing the agreement of the biological function and the relation with its primary and threedimensional structure. The inhibitors of leguminous seeds are found under severa I isoforms. Some methods, as the mass spectrometry, determination of the N-terminal sequence and bidimensional electrophoresis have been widely explored with the purpose of better characterizing these isoforms in seeds. The bidimensional electrophoresis of the Copaiba trypsin inhibitor (CTI) disclosed to the presence of several spots in the 9 and 11 kDa. CTI was resolved in two peaks (CTI-I and CTI-II) when submitted to the reverse phase chromatography in C18 column in HPLC system. These distinct peaks had been submitted to bidimensional electrophorese, 3 spots had been observed for CTI-I with pl of 8.0, 8.5 and 9.0 and three spots for CTI-II with pl of 4.7, 4.6 and 4.3. The analysis for mass spectrometry was carried through for subunits CTI-I and CTI-II objectifying to determine the accurate molecular masses and probable numbers of isoforms for each subunit. The specters had respectively confirmed microheterogeneity for CTI-I and CTI-II with predominance ofthe peaks ofmass 10,719 and 8,244, respectively. The impossibility to sequence ali spots for each subunit of CTI guided the choice of spots more intense (A and F) to continue the sequence studies. Spots A and F had been submitted to the enzymatic digestions with proteases trypsin, SV8 and clostripain. The accurate mass of the peptide of each digest was determined by mass spectrometry using MALDI-TOF MS. The most intense peptides were been purified and sequenced in a LC connected to the spectrometer of mass ESI QTOF. The primary structure of CTI, determined trom the mass of the peptide of the enzymatic digestions and the sequence gotten for mass spectrometry indicated 182 residues of amino acids, presenting a raised degree of similarity to other Kunitz-type inhibitors of the plant, also with the residue of arginine in the position of the reactive site. The crystallographic structure of CTI inhibitor was solved and reveals that, CTI is composed by two non-covalently bound polypeptide chains and only one disulfide bridge. In spite of these structural differences, CTI is an effective trypsin inhibitor with a dissociation constant of 1.2 nM, a value comparable to other standard Kunitz-type inhibitors like STI, ETI or WCI. It three-dimensional structure reveals that this is because the structural discrepancies do not affect the canonical conformation of reactive loop of CTI. The comparison between the sequence deduced from the experimental electron density maps and the sequence determined using 2D-PAGE, MALDI- TOF and ESI-QTOF mass spectrometry shows an agreernent of about 75%, which can be due to the presence of various isoforms that is a common aspect of proteins extracted trom seeds. Experiments objectifying the determination of the important amino acid residues in the inhibitory activity of the CTI were perfomed using specific modifying reagents. The CTI inhibitor was inactivated in 48 and 81% for EDC and PGO, respectively. These composites act in carboxyl group of Asp and Glu (EDC) and residues of arginine (PGO), indicating functionally the importance of the arginine residue in the interaction of inhibitor with protease. Studies of the conformacional stability in different pHs, temperatures and chaotropic agents have given a wealth of information on the structure and biogenesis of proteins. A study verifying the effect of physico-chemical agents (pH, temperature, DTT, urea and guanidine hydrochloride) in the conformacional stability of trypsin inhibitor (CTI) purified trom seeds trom Copaifera langsdorffii was carried through. CTI an atypical inhibitor of the Kunitz family demonstrated to be resistant in its functional stability, although suffering trom damages in the quatemary structure with reduction in 1 mM DTT as evidenced for SDS-PAGE, gel filtration in protein-pack, kinetic experiments, spectrum of fluorescence and circular dichroism. The denaturation experiments in function of the chaotropic agents were monitored by the intensity of the fluorescence of tryptofan residues. The CTI denaturation in the presence of chaotropic agents showed to be a reversible process after dialysis, for structure and function in the case of the urea and guanidine chloride. The results had indicated that the denaturation of CTI involves at least two steps: native and denatured. The presence of 3.5 M of urea or GdnHCI inhibited 50% and 100% of the inhibitory activity, respectively. 80th chaotropic agents had promoted a displacernent of the mass center. The conformational stability calculations dG (H2O) were made by taking the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a pararneter. The dG (H2O) value in function of the concentration of urea and guanidine chloride were 63,0 and 54,0 Kcal mol-1, respectively. The calculations of center of mass were taken as a function of the denaturating agent concentration in both case