Mechanisms of synthesis and degradation of radical nitric oxide by mitochonderia of Arabidopsis thaliana

O objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismo s de síntese e de degradação do radical óxido nítrico (NO) pela mitocôndria vegetal, com ênfase à influência das NAD(P)H desidrogenases e da oxidase alternativa (AOX) nestes processos. Os experimentos foram realizados com mitocôndrias isoladas de células em cultura da planta modelo Arabidopsis thaliana. Inicialmente estabeleceu-se um protocolo para o isolamento e purificação de mitocôndrias, cuja integridade funcional foi determinada pelo controle respiratório, potencial elétrico de membrana e transporte eletroforético de cálcio. Os processos de síntese e de degradação de NO foram analisados monitorando-se o consumo de oxigênio e as concentrações de NO no meio de reação, com eletrodos específicos. Os resultados mostraram que o nitrito inibiu a respiração das mitocôndrias de A. thaliana em competição com o oxigênio do meio. Esta inibição foi revertida por cPTIO, um seqüestrador de NO. Quando a AOX foi inibida por n-propilgalato, o efeito inibitório do nitrito na respiração mitocondrial foi aumentado, enquanto que, na presença de myxothiazol, que previne a redução da citocromo c oxidase (COX), o nitrito não teve efeito na respiração. Os efeitos observados do nitrito no consumo de oxigênio sugeriram que NO foi sintetizado pelas mitocôndrias de A. thaliana através de uma atividade redutora de nitrito. Entretanto, a síntese de NO a partir de nitrito foi principalmente detectada em anaerobiose. Em altas concentrações de nitrito (1-5 mM), a produção de NO se mostrou praticamente insensível aos inibidores da cadeia respiratória, enquanto que, em concentrações menores de nitrito (100 -200 ?M) a COX, mas não a AOX, contribuiu para a síntese de NO. A exposição das mitocôndrias ao NO ou ao nitrito causou uma inibição transiente e menor no consumo de oxigênio quando NAD(P)H f oi utilizado como substrato respiratório, em relação ao succinato. Estas inibições foram potencializadas por superóxido dismutase, sugerindo um mecanismo de degradação de NO dependente de NAD(P)He de oxigênio pelas mitocôndrias de A. thaliana. O conjunto dos resultados mostra que o NO pode ser produzido pela mitocôndria de A. thaliana através de uma atividade redutora de nitrito e que as NAD(P)H desidrogenases e a AOX, além da COX, podem interferir nesta produção. Em aerobiose, a quantidade de NO produzido pode ser controlada pelas atividades de degradação das NAD(P)H desidrogenases e pela COX. A AOX contribui de maneira oposta, ajudando a manter a concentração de NO. Em anaerobiose a atividade redutora de nitrito é favorecida sendo o NO produzido nestas condições pela COX e também devido ao estado mais reduzido da cadeia respiratória. Ainda, em anaerobiose, os mecanismos de degradação de NO, dependentes de oxigênio, estão inibidos. Em conclusão, os resultados deste trabalho mostram a importância das proteínas alternativas da cadeia respiratória da mitocôndria para a homeostase do NO na plantaThe objective of this work was to study the mechanisms of synthesis and degradation of NO by plant mitochondria, with emphasis on the influence of the NAD(P)H dehydrogenases and the alternative oxidase (AOX) in these processes. The experiments were carried out with mitochondria isolated from cells in culture of the model plant Arabidopsis thaliana. Initially, a protocol for the isolation and purification of mitochondria was established, and their functional integrity was determined by respiratory control, electric membrane potential and electrophoretic calcium transport. The processes of synthesis and degradation of NO were analyzed by monitoring oxygen consumption and NO concentration in the reaction medium with specific electrodes. The results showed that nitrite inhibited respiration of A. thaliana mitochondria, in competition with oxygen in the medium. This inhibition was reversed by cPTIO, an NO scavenger. When AOX was inhibited by n-propylgalate, the inhibitory effect of nitrite in mitochondrial respiration was increased, whereas in the presence of myxothiazol, which prevents the reduction of cytochrome c oxidase (COX), nitrite had no effect on respirati on. The observed effects of nitrite in the oxygen consumption suggested that NO was synthes ized by A. Thaliana mitochondria through a nitrite reductase activity. Meanwhile, the synthesis of NO from nitrite was mainly detected under anaerobiosis. At high concentrations of nitrite (1-5 mM), the production of NO was virtually insensitive to inhibitors of the respiratory chain, while at lower concentrations of nitrite (100-200 ?M) COX, but not AOX, contributed for the synthesis of NO. The exposure of mitochondria to NO or nitrite caused a transient and lower inhibition in oxygen consumption when NAD(P)H was used as respiratory substrate, compared to succinate. These inhibitions were enhanced by superoxide dismutase, suggesting an NAD(P)H- and oxygendependent mechanism for NO degradation by mitochondria of A. thaliana. The overall results show that NO can be produced by A. thaliana mitochondria through a nitrite reductase activity and that NAD(P)H dehydrogenases and AOX, in addition to COX, can interfere in this production. In aerobiosis the amount of NO produced can be controlled by the degradation activities of NAD(P)H dehydrogenases and COX. The AOX has an opposite effect, keeping the concentration of NO. In anaerobiosis the nitrite reductase activity is favore d and NO is produced in these circumstances by COX, and also due the more reduced state of the respiratory chain. Additionally, in anaerobiosis, the oxygen -dependent mechanisms of NO degradation are inhibited. In conclusion, the results of this study show the importance of the alternative proteins of the mitochondrial respiratory chain for NO homeostasis in the plan