Characterization of bacterial communities associated with endodontic infections : culture-independent approach

A presente tese teve como objetivo a caracterização das comunidades bacterianas associadas às infecções endodônticas pelo emprego de técnicas moleculares independentes de cultivo. Ao todo, foram analisadas amostras intra-radiculares provenientes de 34 elementos dentários associados a infecções endodônticas. A análise de bibliotecas clonais de DNA ribossomal 16S (16S rDNA) permitiu a identificação de 2 a 14 filotipos bacterianos (espécies) por elemento dentário (média= 9,6), perfazendo um total de 46 filotipos distintos. Dentre estes, 9% foram considerados previamente desconhecidos e classificados taxonomicamente como novos membros da ordem Clostridiales. Espécies reconhecidamente endodônticas dos gêneros Bacteroides, Campylobacter, Eubacterium, Peptostreptococcus, Selenomonas, Treponema e Veillonella foram detectadas, assim como representantes de gêneros menos freqüentemente descritos, como Burkholderia, Filifactor e Megasphaera. O emprego da técnica quantitativa de PCR em Tempo Real, possibilitou a detecção de P. gingivalis, T. forsythia e a coexistência de ambas em 24%, 56% e 18% dos pacientes avaliados, respectivamente. Nenhuma correlação significativa foi evidenciada entre os níveis de ambas as espécies, individualmente ou em conjunto, e a presença de sintomatologia dolorosa. O uso de T-RFLP na avaliação da estrutura das comunidades bacterianas revelou um total de 123 (endonuclease HhaI) e 122 (endonuclease MspI) fragmentos de restrição terminais (T-RFs) distintos, com médias de 20,8 e 20,0 T-RFs por elemento dentário, respectivamente. Aproximadamente 50% dos fragmentos detectados apresentaram-se, no máximo, em 2 pacientes, indicando uma alta variabilidade na composição microbiana. As análises de clusterização e de estatística multivariada não revelaram diferenças significativas nas comunidades bacterianas entre os grupos de estudo assintomático, sensível ao toque e sintomático. De modo geral, os resultados obtidos reiteraram o conceito de que a microbiota associada às infecções endodônticas é essencialmente polimicrobiana, altamente variável entre indivíduos, e constituída predominantemente por bactérias anaeróbias Gram-positivas do filo Firmicutes. As espécies P. gingivalis e T. forsythia, embora relativamente prevalentes nas infecções endodônticas, não apresentaram correlação significativa com o desenvolvimento de sintomatologia dolorosa. Por fim, a ausência de agrupamentos de perfis bacterianos quanto aos parâmetros sintomatológicos sugere que a estrutura das comunidades bacterianas intra-radiculares não possui influência significativa no desenvolvimento da dor de origem endodôntica.The objective of the present study was to characterize the bacterial communities associated with endodontic infections by use of culture-independent molecular techniques. Overall, 34 intraradicular samples from teeth harboring endodontic infections were evaluated. 16S ribosomal DNA (16S rDNA) clone library analysis allowed the identification of 2 to 14 bacterial phylotypes (species) per tooth (mean= 9.6), with a total of 46 distinct phylotypes. Among the latter, 4 (9%) were considered previously unreported and further taxonomically classified as members of the order Clostridiales. Well-known endodontic representatives of Campylobacter, Eubacterium, Peptostreptococcus, Selenomonas, Treponema e Veillonella were detected, as well as members of less frequently reported genera, such as Burkholderia, Filifactor and Megasphaera. The application of the Real Time PCR technique permitted the detection of P. gingivalis, T. forsythia and a coexistence of both in 24%, 56% e 18% of the subjects, respectively. No significant correlations were evidenced among the levels of P. gingivalis and T. forsythia, individually or conjointly, and spontaneous endodontic pain. The use of T-RFLP in the analysis of bacterial community structures revealed a total of 123 (HhaI endonuclease) and 122 (MspI endonuclease) distinct terminal restriction fragments (T-RFs), with 20.8 and 20.0 mean T-RFs per tooth, respectively. Approximately 50% of the detected fragments were exclusive to one or two patients, indicating a high inter-subject variability in the bacterial assemblages. Cluster and multivariate statistical analyses did not demonstrate significant differences in the bacterial community profiles among the asymptomatic, tender to percussion and symptomatic study groups. Taken together, the results of this study reiterate the concept that the microbiota associated with endodontic infections is essentially polymicrobial, highly variable among individuals, and predominantly composed of Gram-positive anaerobic bacteria from the phylum Firmicutes. The species P. gingivalis and T. forsythia, although relatively prevalent in root canal infections, did not present significant correlations with the development of symptomatic features. Lastly, the absence of clusters of bacterial profiles according to symptomatic parameters suggests that the intraradicular bacterial community structures, as a whole, do not bear significant influence on the development of pain of endodontic origin