Simultaneous determination of cafeic and chlorogenic acids by fluorescence

O presente trabalho trata da aplicação da fluorescência molecular e de métodos de calibração multivariados, na modalidade PLS-1, para a determinação simultânea de uma mistura dos ácidos cafêico (CA) e clorogênico (CGA), tanto em amostras sintéticas quanto em amostras reais, provenientes de extratos vegetais aquosos da planta Ilex paraguariensis, aproveitando-se o fato de que ambos os compostos apresentam fluorescência intrínseca. O método desenvolvido não requer reagente, sendo apenas necessário o uso de água aquecida para a etapa de extração. Para tanto, planejamentos fatoriais 2 foram aplicados no sentido de se determinar as condições ótimas para a obtenção da maior sensibilidade, analisando para isso os efeitos principais e a presença de fatores de interação. Esse estudo foi feito para cada um dos ácidos separadamente. Foram feitos dois tipos de planejamentos: um relacionado às variáveis instrumentais e outro sobre as variáveis relacionadas à condição da amostra. Porém, a escolha dos níveis e dos fatores a serem utilizados foi feita a partir de experimentos preliminares, observando-se o efeito de nove variáveis sobre o comportamento de emissão de fluorescência, para cada um dos ácidos. As melhores condições de análise permitiram a obtenção de uma resposta linear para CA na faixa de 0,08-11,1 mmol L, a 284 nm de excitação, com limite de detecção (LD) equivalente a 0,02 mmol L e limite de quantificação (LQ) de 0,07 mmol L (r=0,9972, n=7). Para o CGA a faixa linear foi de 0,3-8,5 mmol L, a 330 nm de excitação, com LD=0,07 mmol L e LQ=0,2 mmol L (r=0,9959, n=8). A etapa seguinte consistiu na construção do modelo de calibração para a mistura, utilizando-se diferentes proporções de CA e CGA (1:7,5; 1:9,5; 1:11,5; 1:13,5; 1:17,5). Os espectros das amostras foram obtidos a 284 nm, e a faixa espectral de 380-500 nm foi decomposta utilizando-se PLS-1. Os dados foram centrados na média, utilizando-se validação cruzada, sem transformação derivativa. O número ótimo de componentes principais encontrados foi de 3 (CA) e 5 (CGA), sendo que 48 amostras foram usadas no conjunto de calibração, e 12 amostras no de validação externa. As concentrações previstas e reais apresentaram-se satisfatoriamente correlacionadas (r=0,990007 e 0,997176 para os modelos do CA e CGA), e para ambos os modelos o desempenho da previsão foi avaliado em termos do coeficiente de variabilidade (CV). A quantificação dos ácidos na amostra comercial foi feita utilizando-se os modelos finais obtidos por PLS-1, sendo validada através da adição de padrão, com boas recuperações obtidas (94±5 % e 104±3 %, para CA e CGA, respectivamente)The present work concerns the application of molecular fluorescence and multivariate calibration method, in the PLS-1 modality, for the simultaneous determination of caffeic (CA) and chlorogenic (CGA) acids in synthetic samples and in real samples of aqueous vegetable extracts of Ilex paraguariensis, using the intrinsic fluorescence of both compounds. The developed method just need the use of warm water for the extraction stage and no chemical is required. A factorial design 2 was applied to get the optimized conditions looking for the largest sensitivity, evaluating the main effects and the presence of interaction factors. This study was performed for each one of the analyte separately. They were performed two types of design: one related to the instrumental variables and other on the variables related to the sample condition. However, the choice of the levels and the factors was based on the preliminary experiments, being observed the effect of nine variables on the behavior of fluorescence emission. The optimized conditions allowed to obtain a linear response for CA in the range of 0.08-11.1 mmol L, using a wavelength of 284 nm for excitation, with a detection limit (LD) equivalent to 0.02 mmol L and quantification limit (LQ) of 0.07 mmol L (r=0.9972, n=7). For CGA the linear response range was 0.3-8.5 mmol L, excitation at a wavelength of 330 nm, with a LD=0.07 mmol L and LQ=0.2 mmol L (r=0.9959, n=8). The construction of the calibration model for the rnixture was consisted in different proportions of CA and CGA (1:7.5; 1:9.5; 1:11.5; 1:13.5; 1:17.5). The spectra of the samples were obtained exciting at 284 nm, and recording the spectral range of 380-500 nm. The data were decomposed using PLS-1. The data set was mean centered, being used the cross validation, without derivative transformation. The optimum number of factors was found as 3 (CA) and 5 (CGA), and 48 samples were used in the calibration set, and 12 samples in one validation group. A satisfactory agreement between predicted and experimental concentrations was obtained (r=0.990007 and 0.997176 for the models of CA and CGA), and for both models the prediction performance was evaluated in terms of the variability coefficient (CV). The acids quantification in the commercial sample was carried out using the final models obtained by PLS-1, being validated through the standard addition, with good recoveries (94±5 % and 104±3 %, for CA and CGA, respectively