Identification of genes and use of promoters regulated by ethanol in sugarcane

A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância social e econômica para o Brasil. Além da produção de açúcar, que coloca o país como o maior produtor mundial, a cana-de-açúcar tem alcançado grande destaque na produção de energia renovável e pouco poluente, o etanol. Devido ao rápido crescimento das áreas cultivadas e do aumento no número de indústrias processadoras da cana-de-açúcar, milhares de novos empregos têm sido gerados no Brasil. Por se tratar de uma cultura tão importante para a sociedade e economia brasileira, a cana-de-açúcar vem ganhando cada vez mais destaque e atenção das instituições de pesquisa públicas e privadas. Grande parte da pesquisa e experimentação desenvolvida atualmente para esta cultura visa o desenvolvimento de variedades mais adaptadas às condições edafoclimáticas do Brasil e mais resistentes e tolerantes contra pragas e doenças. Outro importante campo de estudo que tem sido bastante focado no momento é a compreensão dos mecanismos bioquímicos da síntese de sacarose com a finalidade de aumentar a produção deste açúcar e conseqüentemente de etanol. O desenvolvimento de um sistema genético capaz de modificar o metabolismo da planta, através de um estímulo artificial, pode ser muito útil no aumento da produtividade e qualidade ou na redução dos custos envolvidos com a produção de cana-de-açúcar. Esta tecnologia poderá contribuir significativamente para um avanço ainda maior da cana-de açúcar no país. A partir desta premissa, o presente estudo buscou identificar e caracterizar um sistema de indução de expressão gênica disparado pela aplicação externa de etanol em folhas de cana-de-açúcar. Para isso, fazendo uso da técnica de macroarranjos de cDNA, analisamos a expressão gênica de 3.575 ESTs, isolados de folhas de cana-de-açúcar, em resposta a aplicação de etanol. Setenta ESTs apresentaram padrão de expressão alterado pelo etanol. Dentre estes, foram identificados ESTs que codificavam para proteínas relacionadas ao processo de transcrição e tradução e estresse abiótico. Muitos genes cuja função ainda permanece desconhecida também foram identificados nesta análise. Dos 70 ESTs identificados, 48 tiveram expressão induzida pela aplicação de etanol. A partir dos ESTs selecionados como induzidos pelo tratamento com etanol, foi possível selecionar o gene ERD (early responsive dehydration) como candidato para identificação e caracterização da sua seqüência promotora. O EST do gene ERD apresentou um perfil de expressão interessante, com expressão basal baixa durante os tratamentos controle e indução da expressão após a primeira hora de tratamento com etanol. Estudos realizados com várias espécies de plantas demonstram que o sistema alc é um sistema eficiente de expressão gênica baseado na indução por etanol. A partir desta informação, desenvolvemos um vetor de expressão contendo o promotor alcA regulando a expressão do gene repórter da ß-glucuronidase e em seqüência, o promotor constitutivo Ubi-1 de milho controlando a expressão do gene alcR, um fator de transcrição indispensável para a ativação do sistema. Posteriormente, esta construção foi utilizada para transformação genética de plantas de cana-de-açúcar que no momento estão sendo selecionadas e analisadas quanto a introgressão estável do cassete gênico. Outra etapa do presente estudo foi realizada com o gene SsNAC23, já descrito como induzido por estresse de frio, estresse hídrico e herbivoria. Neste trabalho foi demonstrado que SsNAC23 também é induzido pela aplicação de etanol nas folhas de cana-de- açúcar logo após uma hora de exposição ao agente indutor. Concluindo, os resultados obtidos neste trabalho contribuem para elucidar questões importantes do processo de regulação da expressão gênica induzida por etanol, além da validação de um processo útil para aplicação na agricultura. A partir dos dados gerados nas análises de macroarranjos de cDNA foi possível ainda, validar um novo método de quantificação do erro estatístico resultante das análises realizadas no programa SOM (Self Organizing Maps).The sugarcane is a very important crop in Brazil, the biggest producer of the World. Besides sugar, the sugarcane is also used to produce ethanol, a very important renewable source of energy in Brazil. Nowadays this crop is responsible for generation of thousands of job positions directly and indirectly linked to the sugar and ethanol industry and market. Since the sugarcane is getting an important role in the Brazil economy, Brazilians researchers are focusing a lot of work in this crop to breed new varieties with improved traits and better adaptation to stressing environmental, such as cold, poor and acid soils, and attack of pests and diseases. Other important field of study is the improvement of sucrose content to increase the efficiency of ethanol production. The development of a genetic system triggered by an external stimulus and able to modify the plant metabolism may be very useful to improve productivity and quality, besides the cost reduction of sugarcane production. This technology might permit Brazil to increase the expansion of this crop without degrading the environmental. Therefore, the aim of this work was the identification of an efficient system of gene expression induced by ethanol. The technique of cDNA array was used to check the expression of 3,575 ESTs isolated from sugarcane leaves previously treated with ethanol. Seventy ESTs showed expression profile altered by ethanol. Among these ESTs with altered expression we have identified sequences encoding proteins involved with transcription and translation and genes previously reported as responsive to abiotic and biotic stresses. Forty eight of the 70 ESTs with altered expression were up-regulated by ethanol. The SsNAC23, a gene induced by cold, dry and insect attack, was also responsive to ethanol in this study. The expression of SsNAC23 in sugarcane leaves was increased after one hour of exposition to ethanol. The expression analysis of genes induced by ethanol in arrays filters allowed us select a candidate gene whose promoter region will be identified and studied. The gene chosen was the ERD, Early Responsive to Dehydration, whose expression profile was the absence of expression under control treatment and high induction after one hour of ethanol application. Previous works have showed that the genetic system based in ethanol induction, also known as alc system, can be very useful in crops. This system was tested in several plant species and the results were very promising. Therefore, one of the goals of this work was the production of genetic altered sugarcane plants with the alc system. For that, we have developed an expression cassette using the alcA promoter regulating the expression of the ß -glucuronidase, used as a reporter gene, and the constitutive promoter Ubi-1 from maize controlling the expression of the gene alcR, a transcriptor factor essential to ctivation of the alc system. The transformed sugarcanes are being analysed and selected to construct introgression. The results obtained in this work will contribute to understanding of gene expression regulation using an external and chemical inductor as well as provide new insights to the development of new approaches of gene expression control in sugarcane. Besides that, the array data was also used to validate a new statistical method of error estimation by using the SOM software