Evaluation of cytotoxic molecules production by peripheral blood lymphocytes (CD8+ and CD4+) of patients with paracoccidioidomycosis

Em doenças causadas por microorganismos intracelulares como a tuberculose, criptococose e listeriose foi demonstrado que as células T CD8+ contribuem de forma relevante para o controle da infecção. Em trabalho anterior verificamos um aumento do número de linfócitos T CD8+ no lavado broncoalveolar de pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) pulmonar, sugerindo um papel para estas células, cuja ação efetora se dá por meio da produção de citocinas como o IFN-y e atividade citotóxica. O presente estudo teve por objetivo verificar o estado de ativação e a produção de moléculas citotóxicas por linfócitos do sangue periférico (CD4+ e CD8+) de pacientes com PCM, indivíduos com PCM-Infecção e controles, tanto ex-vivo como in vitro, após estimulação com leveduras de P. brasiliensis. A expressão dos marcadores de ativação e moléculas citotóxicas foi avaliada por citometria de fluxo. A análise ex-vivo mostrou que, de maneira geral, os pacientes apresentam menor freqüência de células positivas para moléculas citotóxicas (granzima A, B e perforina), em relação aos indivíduos com PCM-infecção. A estimulação com leveduras de P. brasiliensis levou a um aumento discreto de células ativadas (CD69+) e uma redução na expressão de grânulos citotóxicos. A adição de IL-15 às culturas mostrou elevação da freqüência de células CD69+ apenas no grupo com PCM-infecção e controles. Já as células T CD4+ e CD8+ dos pacientes foram ativadas apenas na ausência do fungo. O efeito da adição de IL-15 na expressão dos grânulos foi pouco expressivo em relação à granzima A e B, mas maior freqüência de células CD8+perforina+ foi observada em indivíduos com PCM-infecção, em relação aos pacientes. Menor expressão do receptor para IL-15 (IL-15R?) foi detectada em células T CD4+ de pacientes com PCM comparada ao grupo PCM-infecção e aos controles. A dosagem da granulisina sérica pela metodologia de ELISA mostrou níveis inferiores nos pacientes com PCM, comparado aos outros grupos. Além disso, os resultados mostraram uma tendência a um aumento de granulisina nos pacientes após terapia antifúngica. Em conjunto os resultados mostraram que os linfócitos de pacientes com PCM encontram-se em um estado de menor ativação, expressam menores quantidades do receptor para IL-15 e produzem níveis basais de grânulos citotóxicos (granzima A, B, perforina e granulisina). Estes fatores, ao lado de outros mecanismos que comprometem a imunidade celular, poderiam resultar em atividade citotóxica deficitária e, portanto, menor capacidade de lisar o fungoCD8+ T cells play a pivotal role in host defense against diseases caused by intracellular pathogens such as tuberculosis, cryptococcosis and listeriosis. In a previous study we verified an increased number of T CD8+ cells in bronchoalveolar lavage of patients with pulmonary paracoccidioidomycosis (PCM), suggesting a role for them in the local immune response. CD8+ T cells effector functions include cytokines production, mainly IFN-? and cytotoxic activity. The aims of this study were to verify the activation state as well as the production of cytotoxic molecules by peripheral blood lymphocytes (CD8+ and CD4+) from patients with PCM, individuals with PCM-infection and controls, both ex-vivo and in vitro after stimulation with P. brasiliensis yeast cells. The expression of activation and cytotoxic molecules was evaluated by flow cytometry. The ex-vivo analysis showed that, in general, the patients presented a lower frequency of granzime A, B and perforin-positive cells as compared to PCM-infection individuals. P. brasiliensis yeast cells stimulation led to a discrete increase in CD69+ cells and a reduction in cytotoxic granules expression in all groups. The addition of IL-15 to the cultures induced an increase in the frequency of CD69+ cells only in individuals with PCM-infection and controls. Differently, CD8+ and CD4+ T cells from PCM patients were activated only in the absence of fungal cells. The effect of IL-15 in granzyme A and B expression was low but a higher frequency of CD8+perforin+ was detected in individuals with PCM-infection than in patients with PCM. IL-15R? expression was lower in CD4+ T cells from patients in relation to individuals with PCM-infection and controls. The detection of granulysin levels by ELISA showed lower levels in PCM patients than in individuals with PCM-infection and controls. Moreover, a tendency to a rise in granulysin levels was observed after antifungal therapy. Altogether the results showed that lymphocytes from PCM patients are poorly activated, express low levels of IL-15R? and produce basal levels of cytotoxic granules (granzyme A, B, perforin and granulysin). These findings, in addition to other mechanisms that impair cellular immunity, may account to defective cytotoxic activity and consequently low capacity to kill the fungu