Regulação da expressão do promotor do gene do receptor de glicocorticoide em clones de celulas transfectadas com o photo-oncogene c-jun

Os hormônios glicocorticóides, com conhecida ação antiinflamatória e antitumoral, agem apenas em células com receptores citoplasmáticos específicos ( GR ), portanto se toma extremamente importante conhecer os mecanismos envolvidos na regulação da expressão destes receptores para avaliar a resposta ao hormônio. Trabalhos preliminares realizados pelo nosso grupo em células transformadas pelo oncogene EJ-ras apontam para uma regulação negativa de GR a nível transcricional de GR decorrente desta transformação. Entretanto, a oncoproteína não pode regular diretamente a transcrição gênica já que está ancorada à membrana celular. O promotor do gene de GR possui um elemento similar a AP-I e isto, aliado ao fato de que Ras participa diretamente do processo de fosforilação de c-Jun, sugere que o produto deste proto-oncogene pode ser um dos alvos nucleares de Ras para a regulação do promotor do gene de GR. O presente trabalho teve como objetivo determinar o papel de c-Jun na regulação do promotor do gene de GR e analisar a capacidade de ligação da proteína c-Jun ao elemento AP-l presente neste promotor. Para tanto foram gerados clones de células NIH3 T3 transfectadas com c-jun e estes foram analisados quant.o à expressão do RNA mensageiro ( RNAm ) de c-jun e GR, bem como as respectivas proteínas por eles codificadas. A análise dos dados da expressão de c-Jun e GR, a nível de RNAs mensageiros e de proteínas, mostram que nos clones onde há aumento do RNAm de c-jun há decréscimo do RNAm de GR, sugerindo que a presença de c-Jun possa atenuar a transcrição do gene de GR. Entretanto nem sempre se encontrou uma correlação inversamente proporcional entre o RNAm de c-jun e de GR. Os valores obtidos após a determinação da concentração das proteínas c-Jun e GR evidenciam um padrão de regulação gênica muito mais complexo. Novamente ficou constatado que não havia correspondência entre os valores dos RNAs mensageiros e proteínas c-Jun e GR. Foram realizados ainda ensaios de retardamento de mobilidade eletroforética, utilizando a seqüência AP-l do promotor do gene de GR e extratos nucleares dos clones NIH3 T3 c-jun. Estes experimentos comprovam uma regulação mais complexa, pois mostram que a proteína c-Jun contida nos extratos nucleares não é capaz de se ligar à seqüência similar à AP-l contida no promotor do gene de GR. Concluindo que. a regulação do gene de GR por c-Jun não é dada diretamente por sua interação com o elemento específico contido no promotor deste geneGlucocorticoid receptors ( GR ) mediate the cellular response to glucocorticoid hormones which are known for their anti-inflammatory and anti-tumoral actions. The mechanisms involved on the regulation of GR gene expression are extremely important for the cellular response to the hormone and remain unknow. Using transient transfections, we have previously reported that cells transformed with the oncogene EJ-ras had an attenuation on the GR gene transcription. However, this effect could not be mediated through a direct action of the oncoprotein on the gene transcription, once Ras is anchored at the cellular membrane. An AP-l like site was found in GR gene promoter and the fact that Ras protein activates fosforilation of c-Jun suggests that it might be a Ras' nuclear target and oÍle of the transcription factors responsible for the regulation of GR gene expression. The aim of this work was to settle the role of c-Jun on GR expression and evaluate the c-Jun ability to bind the AP-l like site present on GR gene promoter. In this study we generated NIH3T3 cells dones stabled transfected with c-jun and analyzed their c-Jun and GR mRNA and protein contents. We observed that dones with higher c-jun mRNA levels have lower GR mRNA when compared with non transfected cells suggesting that c-Jun can attenuate the GR gene transcription. We did not find a direct correlation between mRNA and protein levels of both c-jun and GR. These data indicate that a more complex mechanism may be involved. Eletrophoretic mobility shift assays were performed to test the binding of c-Jun to the AP-l like site present on the GR gene promoter. The results showed that this association is much lower than the one observed by the consensus AP-l, suggesting that the GR gene expression regulation by c-Jun does not seem to be due to its interaction with the AP-l like site present on the GR gene promote