Estudo dos mecanismos moleculares de resistencia a claritromicina e tetraciclina em linhagens de Helicobacter pylori

Helicobacter pylori é uma bactéria Gram-negativa e microaerofilica associada a diversas doenças gástricas, como gastrite crônica, úlcera péptica e câncer gástrico. As terapias de erradicação do H. pylori geralmente consistem no uso de dois ou três antimicrobianos combinados com um inibidor de bombas de prótons. Em geral, o metronidazol, a cIaritromicina e a amoxicilina usados na terapia de erradicação, enquanto os tratamentos com tetraciclina são utilizados como uma segunda opção em pacientes que não erradicaram a bactéria. Embora os tratamentos anti-H. pylori ainda sejam muito efetivos, recentemente as taxas de erradicação têm sido influenciadas negativamente pelo aumento no número de bactérias resistentes. o uso indiscriminado da cIaritromicina tem resultado em um aumento na taxa de resistência a este antibiótico, sendo considerado como a principal causa da falha terapêutica. A resistênda do Helicobacter pylori a cIaritromicina tem sido associada às mutações A2142G e A2143G no gene 235 rRNA. Até o fim do século passado a resistência a tetraciclina não era muito comum, entretanto, nos últimos anos esta resistência vêm aumentando. Alguns estudos indicam que o mecanismo molecular de resistência a tetradclina está relacionado a mutações no sítio primário de ligação deste antibiótico, localizado no gene 165 rRNA. Os objetivos do presente trabalho foram: determinar a prevalência de cada tipo de mutação em 52 linhagens de H. pylori resistentes a cIaritromicina; e caracterizar a influência de cada tipo de mutação no OM e, descrever o mecanismo molecular de resistência a tetraciclina em cinco amostras resistentes a este antibiótico.Alémdisso,desenvolverum métodorápidobaseado em PCR-RFLP para a detecção de linhagens resistentes a tetraciclina. Tendo em vista que em cerca de 94% de nossas amostras a resistência a claritromicina é mediada pelas mutações de ponto A2142-G e A2143-G, a metodologia empregada para a detecção destas mostrou-se eficiente na identificação de linhagens ClaR,Desse modo, sugerimos que, devido à sua rapidez e precisão, a detecção de linhagens resistentes a claritromicinapor PCR-RFLP poderia ser utilizado rotineiramenteantes da escolha da terapia antimicrobiana. Os dados obtidos no presente trabalho confirmam que a substituição AGA926-92T8T-C, presente nas cinco amostras estudadas, é responsável por conferir a resistência à tetraciclina. Além disso, desenvolvemos uma metodologia capaz de detectar a presença da substituição AGA926-92T8T-C, responsável por mediar a resistência à tetraciclina em H. py/ori. O PCR-RFLP mostrou-se muito eficaz na identificação de linhagens resistentes a tetraciclina. Desse modo, podemos concluir que essa metodologia permite uma rápida identificação de linhagens resistentes à tetraciclina sem a necessidade da cultura bacteriana.Helícobacterpylori is a gram-negative bacterium that colonizes the human stomach and is associated with a variety of digestive diseases, such as chronic gastritis and peptic ulcer disease. Successful treatment of H. py/ori infection not only results in the eradication of the pathogen, but often also cures and prevents the development of the associatecl diseases. Infection with H. pylori can be effectively treated by the combination of a proton pump inhibitor with multiple antibiotics. The first-line regimen consists mainly of a triple therapy, and clarithromycinis one of the most widely used components. Tetracycline-based combination regimens are often usecl after first-line treatment with amoxicillin, clarithromycin and/or metronidazolefails,or when recluction of treatment costs are important. Although most anti-H. pylori regimens are still highly effective, the eradication rates of these therapies are negatively affectecl by the increasing incidence of antibiotic resistance.The increasing use of clarithromyanhas resulted in the development of resistance. Resistance of Helícobacter pylori to clarithromycin has been associated with A2142G and A2143G point mutations in the 235 rRNA gene. Although most of H. pylori isolates are still susceptible to tetracycline, in the past few years the incidence of tetracycline resistance has increased. The molecular mechanism underlying this resistance is attributed to mutations in the primary binding site of tetracycline in the 165 rRNA gene. Thus, the aims of the present study were: to determine the prevalence of each mutation in 52 clarithromycin-resistant H. pylori strains and to characterize the influence each type of mutation on the MIC;and describe the molecular resistance mechanism of tetracycline resistance in tive high-Ievel tetracycline resistant H. pylori strains. These data have subsequently been used for the developmentof a molecular screening approach for tetracycline resistance using PCR-RFLP. Regarding the clarithromycin resistance, our results support the hypothesis that the A2142G and A2143G mutations in the 235 rRNAgene of H. pylori are linked to clarithromycin resistance. This finding may have a significant impact on patient management, providing rapid information for the clinician, allowing, for example, appropriate antibiotic prescription and prediction of treatment outcome Concerningtetracycline resistance we showed that among ali tetracycline resistant strains the resistance was mediated by the triple basepair substitution AGA926-92-8TTC in the 165 rRNA gene. Additionally,a PCR-based restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)assay was developed for the rapid detection of the AGA926-92T8T-C substitution, and confirmed the presence of the aforementioned substitution in ali tive Brazilian isolates. This PCR-RFLP based approach that distinguishes the high-Ievel TetR isolates from the low-Ievel TetRand TetS H. pylori strains allowing a rapid detection of clinically relevant levels of tetracycline resistance in H. pylori