Inherited thrombophilias among young patients with ischemic stroke

Introdução e Objetivo: A etiologia de acidentes vasculares cerebrais isquêmicos (AVCi) em pacientes jovens permanece desconhecida em um terço dos casos, justificando a procura por novos fatores de risco protrombóticos. Causas comuns de trombofilia hereditária incluem o fator V de Leiden, a mutação G20210A no gene da protrombina, e hiperhomocisteinemia moderada secundária à variante termolábil da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR-T). A atividade da paroxonase (PON1), uma esterase associada a lipoproteínas de alta densidade (HDL) com propriedades antioxidantes e antiaterogênicas, é determinada pelos polimorfismos Q192R e L55M da região codificadora e pelas substituições C(-107)T e G(-824)A no promotor do seu gene. A correlação destes fatores genéticos com o risco de AVCi é controversa. Além disso, foi recentemente descrita em crianças com AVCi uma deficiência hereditária de glutationa peroxidase plasmática (GPx-3), uma enzima com função de inativar espécies reativas de oxigênio que limitam a biodisponibilidade e os efeitos antiplaquetários do óxido nítrico. Porém, a base molecular dessa alteração ainda não foi identificada. Métodos: Analisamos e 118 a 167 pacientes jovens (< 45 anos) com AVCi não-fatal de etiologia indeterminada e um número equivalente de controles pareados por sexo e idade quanto à presença de fatores de risco protrombóticos. O fator V de Leiden, a variante da protrombina, homozigose para MTHFR-T, e as substituições Q192R, L55M e G(-824)A no gene da PON1 foram determinados através de PCR e digestão com enzimas de restrição. O polimorfismo PON1 C(-1O7)T foi detectado através de análise por single-strand conformational polymorphism (SSCP). Rastreamento do gene da GPx-3 foi realizado através de análise por SSCP, seguido de seqüenciamento de fragmentos com shift eletroforético. Resultados: A prevalência do genótipo 192RR da PON1 foi significativamente mais elevada em pacientes jovens com AVCi que controles (P=0.006), sendo o fator de risco que demonstrou a associação mais forte com AVCi de todos os fatores genéticos estudados (OR=4.1, 95% CI, 1.14 to 14.73). A presença isolada do alelo de baixa expressão -107T causou um aumento modesto no risco de AVCi, porém demonstrou ação sinergística com o genótipo 192RR, elevando a estimativa de risco de AVCi em portadores de ambas as variantes para 17 (95% CI, 1.74 to 166.35; P=0.015). Através de rastreamento do gene da GPx-3 por SSCP, identificamos quatro polimorfismos novos, ligados, no promotor do gene, associados ao risco de AVCi: A(-68)T, A(-622)T, T(-688)C e A(-703)C. Portadores do haplótipo combinando os nucleotídeos -622T, -688C e -703C foram significativamente mais prevalentes entre pacientes que controles (27.6% vs. 15.4%; P=0.020) e tiveram um risco de AVCi duas vezes maior quando comparado a não-portadores (OR=2.09, 95% CI, 1.12 to 3.92). O risco de AVCi associado ao genótipo PON1 192RR e aos polimorfismos do promotor da GPx-3 foi potenciado em indivíduos simultaneamente expostos a fatores de risco vasculares convencionais. Nenhuma diferença significativa na prevalência de fator V de Leiden, da variante da protrombina, ou homozigose para MTHFR-T foi encontrada entre pacientes e controles, com exceção de uma freqüência elevada de MTHFR-T em um grupo pequeno de indivíduos de origem negróide (OR=5.9, 95% CI, 0.88 to 49.2). Conclusões: Estes dados demonstram que variantes genéticas em enzimas antioxidantes predispõem ao desenvolvimento precoce de AVCi e sugerem um novo mecanismo para trombose arterial que envolve a biodisponibilidade diminuída de óxido nítrico. Além disso, a interação dos fatores genéticos com fatores de risco convencionais concordam com o conceito atual de que as doenças aterotrombóticas, incluindo AVCi em jovens, têm etiologia multifatorialBackground and Purpose: The etiology of arterial ischemic stroke (AIS) in the young remains unknown in up to one-third of patients, warranting the search for novel prothrombotic risk factors. Common causes of inherited thrombophilia inc1ude factor V Leiden, the prothrombin G20210A mutation, and mild hyperhomocysteinemia due to the thermolabile variant ofmethylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR-T). Activity levels of paraoxonase (PON1), an antioxidant and antiatherogenic HDL-bound esterase, are determined by the Q192R and L55M coding region polymorphisms and the C(-107)T and G(-824)A substitutions in the gene promoter. The correlation of these genetic factors with the risk of AIS is controversial. In addition, a heritable deficiency of plasma glutathione peroxidase (GPx-3), a reactive oxygen species scavenger that protects the bioavailability and antiplatelet effects of nitric oxide (NO), was recently described in association with childhood stroke, yet a molecular basis for this defect has not been identified. Methods: We analyzed up to 167 young patients (< 45 years ofage) with non-fatal AIS of undetermined etiology and an equivalent number of age- and gender-matched controls for the presence of inherited prothrombotic risk factors. Factor V Leiden, the prothrombin variant, homozygosity for MTHFR-T, and the Q192R, L55M, and G(-824)A substitutions in the PON1 gene were determined by PCR amplification and restriction digestion. The PON1 C(-107)T polymorphism was detected by single-strand conformational polymorphism (SSCP) analysis. Screening ofthe GPx-3 gene for genetic abnormalities was performed by SSCP, followed by sequencing offtagments with electrophoretic shifts. Results: The prevalence of the PONl 192RR genotype was significantly higher among patients than controls (P=0.006),showing the strongest independent association with the risk of AIS among all the genetic risk factors studied (OR=4.1, 95% CI, 1.14 to 14.73). The presence of the low expressor PON1 -107T allele was only modest1yassociated with AIS when ana1yzed alone, yet further increased the risk conferred by the 192RR genotype, yielding an adjusted risk estimate of 17 in carriers ofboth variants (95% CI, 1.74 to 166.35; P=0.015). By SSCP screening of the GPx-3 gene we identified four novel linked polymorphisms in the promoter associated with the risk of AIS: A(-68)T, A(-622)T, T(-688)C, and A(-703)C. Carriers ofthe haplotype combining nucleotides -622T, -688C, and -703C were significantly more frequent among patients than controls (27.6% vs. 15.4%; P=0.020) and had twice the risk of AIS as compared to non-carriers (OR=2.09, 95% CI, 1.12 to 3.92). The risk associated with the PON1 192RR genotype and the GPx-3 promoter polymorphisms was potentiated in individuaIs simultaneously exposed to conventional vascular risk factors. No significant difference in the prevalence of factor V Leiden, the prothrombin variant, and homozygosity for MTHFR-T was found between patients and controls, with the exceptio~ of a higher frequency of MTHFR-T in a small group ofindividuals of African descent (OR=5.9, 95% CI, 0.88 to 49.2). Conclusions: These data indicate that genetic variants in antioxidant enzymes predispose to the early development of AIS and support a novel mechanism for arterial thrombosis that involves reduced bioavailablity ofNO. In addition, the interaction ofthese genetic markers with conventional vascular risk factors support the current concept that atherothrombotic disease is a complex trait and multifactorial in natur