Study of the isoelectric precipitation of porcine insulin in aqueous solutions with carbon dioxide

A técnica de precipitação é freqüentemente utilizada na recuperação de proteínas de soluções aquosas. Uma das formas de se realiza-la é através do processo de precipitação isoelétrica, que consiste no ajuste do pH do meio ao valor em que a proteína tem carga global nula, ou seja, no ponto isoelétrico, pI. Ácidos e bases minerais são normalmente utilizados para ajustar o pH do meio ao pI e provocar a precipitação de proteínas. Contudo, para se obter proteínas de alta pureza e evitar a poluição do meio com resíduos indesejáveis, há a necessidade de um processo adicional para a neutralização da solução e remoção dos sais gerados. Além disso, concentrações locais elevadas dos ácidos podem causar a desnaturação da proteína de interesse. Estudos recentes vêm apontando a utilização de eletrólitos voláteis como uma alternativa promissora aos agentes de precipitação convencionalmente empregados na recuperação de proteínas. Eletrólitos voláteis são obtidos pela dissolução de gases como o dióxido de carbono em solução aquosa; nesta dissolução formam-se íons, cujas concentrações dependem da temperatura e pressão do sistema. Biomoléculas de interesse farmacêutico, como a insulina, por exemplo, podem ser potencialmente recuperadas por processos de precipitação isoelétrica com o CO2. Assim, neste projeto realizou-se um estudo experimental e teórico da precipitação isoelétrica da insulina suína com dióxido de carbono, avaliando-se a influência dos parâmetros de processo como a temperatura, pressão e concentrações de eletrólitos e de proteínas sobre a precipitação. A cinética de variação de pH devida à acidificação das soluções contendo a insulina foi determinada, assim como a cinética de precipitação da proteína. A utilização do bicarbonato de sódio como agente tamponante, em conjunto com o ácido carbônico formado em solução, permitiu que os estudos de equilíbrio fossem realizados sem a necessidade de nenhum componente adicional para o controle do pH do sistema. Dados de solubilidade da insulina suína foram obtidos entre as temperaturas de 5 e 25oC, até a pressão de 16 bar de CO2. Estes dados foram correlacionados por um modelo termodinâmico em que a proteína em solução foi considerada como um eletrólito, o que permitiu uma análise do efeito de forças eletrostáticas sobre a solubilidade da proteínaPrecipitation is a technique frequently employed in downstream process for the recovery of proteins from aqueous solutions. One example of such technique is the isoelectric precipitation, which consists of the adjustment of solution pH to the value where the protein has zero net charge, the isoelectric point, pI. Commonly, mineral acids and bases are used for pH adjustment and to induce protein precipitation. However, in order to obtain high purity proteins and avoid environmental pollution, an additional process is needed to neutralize and remove residual salts. It is also necessary to take into account the fact that local pH extremes can cause denaturation of the targeted protein. Recent works have pointed the use of volatile electrolytes as promising alternatives to the precipitating agents conventionally utilized in protein recovery. Volatile electrolytes are obtained by dissolution of gases as carbon dioxide in aqueous solutions. In this process, the volatile electrolyte dissociates into ions, whose concentrations depend on system pressure and temperature. Biomolecules of pharmaceutical interest as insulin, for instance, may be potentially recovered by isoelectric precipitation process with carbon dioxide. Thus, in this project an experimental and theoretical study of the isoelectric precipitation of porcine insulin with carbon dioxide was conducted, in order to evaluate the influence of parameters such as temperature, pressure and concentrations of electrolytes and protein over the precipitation process. Kinetics of pH variation due to acidification of the insulin solutions was determined, as well as protein precipitation kinetics. The use of sodium bicarbonate as buffer agent with carbonic acid produced in solution allowed the equilibrium studies be conducted without the need of any additional component to control system pH. Solubility data of porcine insulin were obtained in the temperature range of 5 to 25oC and up to CO2 pressures of 16 bar. These data were correlated by a thermodynamic model in which the protein in solution was considered as an electrolyte, which allowed an analysis of electrostatic force effects over protein solubilit