Estudo da precipitação de tripsina com uso de sais volateis

A precipitação induzida pela adição de sais é um processo freqüentemente utilizado na purificação de proteínas em solução aquosa. Após a separação da proteína, o sal presente no precipitado deve ser removido e a solução remanescente necessita de tratamento para que os eletrólitos sejam recuperados e reutilizados no processo, para reduzir o custo e evitar a contaminação do meio ambiente. A precipitação com uso de sais voláteis pode ser uma alternativa a este tipo de processo pois, por elevação de temperatura ou abaixamento de pressão, o eletrólito passa para a forma gasosa e pode ser reutilizado sem purificação adicional. Neste trabalho foi estudada a precipitação de tripsina suina a 4°C utilizando-se o sal volátil carbamato de amônio ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO), preparado a partir de carbonato de amônio e hidróxido de amônio de modo que a razão entre as quantidades totais de nitrogênio e carbono (RNlc) fosse. igual a 2,0. A solubilidade da tripsina foi determinada experimentalmente: as concentrações de proteína das fases sobrenadante e precipitado foram obtidas por absorção a 280 nm e confinadas por liofilização. Balanços de massa foram verificados, bem como o tempo necessário para que o equihbrio fosse atingido. Por ser a tripsina uma enzima proteolítica, que apresenta problemas específicos de autólise em seu pH ótimo igual a 8,0, e devido ao caráter básico do sal carbamato de amônio, ensaios de atividade enzimática e avaliação do nível de autólise foram efetuados. Os estudos realizados demonstram que o carbamato de amônio é capaz de induzir a precipitação por "salting-out" da tripsina, e que o acréscimo de amônia ao sistema reduz a efetividade da precipitação. Da análise do balanço de massa observou-se que a concentração inicial de proteína não afeta sua solubilidade, e que o estado de equilibrio é atingido após 1 h. Comparando-se os resultados de atividade total recuperada da tripsina precipitada com o sal volátil e com sulfato de amônio verificou-se a diminuição na atividade da proteína precipitada com carbamato de amônio. Este comportamento é devido provavelmente a um efeito desnaturante do carbamato de amônio, conforme observado por meio de eletroforese SDS-PAGE. Estudos para a remoção do sal volátil da solução de tripsina no processo de precipitação por "salting-out" foram realizados, de modo a demonstrar que a utilização do sal para a precipitação em larga escala é factívelSalt-induced precipitation is an extensively used method to purify proteins in aqueous solution. Once precipitation is carried out, additionaI separation steps are necessary both to remove the salt ITomthe precipitate, which is often accomplished by dialysis, and to treat the remaining aqueous phase to recover biomolecules still in solution and to prepare the solution for final disposal or recycling. This post-precipitation treatment can be very costly. The use of volatile electrolytes, which can be removed ITomthe solution by temperature increase or pressure decrease, can be an economically attractive alternative for the precipitation process by conventionaI salts. In this work, the precipitation of suine trypsin at 4°C with the volatile salt ammonium carbamate ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO) was investigated. The solubility curve of trypsin was determined by .measuring absorbance at 280 nm of precipitate and supernatant phases, and con:firmed by lyophilization. Mass balance was verified as well as the time necessary to reach the equihDrium.Once trypsin is a proteolitic enzyme presenting autolysis problems at pH equal to 8,0, which is close to the pH of ammonium carbamate solutions, the activity recovery and autolysis leveI in the process were investigated. Experimental results showed that ammonium carbamate is able to induce the trypsin precipitation by salting-out. Mass balance indicated tOOtthe solubility of trypsin is independent of the inicial protein concentration and the equihDriumis reached afier 1 hour. Comparative results of the total activity recovered of the trypsin precipitated with ammonium carbamate and ammonium sulfate showed a decrease of 20% in the activity of the protein precipitated with ammonium carbamate. These results can bé related to denaturing effect of ammonium carbamate as suggested by SDS-PAGE ana1ysis.Volatile salt remova! in the protein solution afier the salting out precipitation was studied to demonstrate the feasibilityofthis precipitation techniqu