Evaluation of protein and metalloprotein changes in soybean seed after genetic modification process

Este trabalho de pesquisa consistiu na comparação entre dois tipos de soja [Glycine max (L.) Merrill], transgênica e não-transgênica, em termos proteômicos e metaloproteômicos. Primeiramente, as proteínas de soja foram extraídas utilizando-se um tampão extrator contendo Tris-HCI (pH 8,8), KCI, DTT, PMSF e SDS e, então, estas foram quantificadas pelo método de Bradford. Em termos de concentração de proteínas totais, os dois tipos de soja apresentaram resultados próximos, sendo encontrados 8,2 ± 0,3 mg mL na soja transgênica e 11,0 ± 0,1 mg mL na soja não-transgênica. A seguir, as proteínas de soja foram separadas por 2-D PAGE. O processo eletroforético foi otimizado, de modo a obter géis com uma boa resolução, e os perfis proteômicos dos dois tipos de soja avaliados foram comparados. Em géis obtidos na faixa de pl entre 4 e 7, a soja transgênica apresentou, em média, um maior número de spots protéicos (408 ± 27) do que a soja não-transgênica (397 ± 26) e a probabilidade de identidade entre o conjunto de proteínas para os dois tipos de soja foi de apenas 35,0%. Em uma etapa posterior, 10 spots protéicos foram retirados do gel de poliacrilamida, digeridos com tripsina e analisados por MALDI-TOF MS, de modo que as proteínas presentes nestes foram caracterizadas. As proteínas LEA protein e early nodulin 75 (precursor) apresentaram diferenças em sua expressão, conforme observado pelos diferentes volumes normalizados de seus spots nos géis de eletroforese para cada tipo de soja. Os íons metálicos Ca, Cu, Fe, Mn, Ni e Zn foram mapeados em algumas proteínas de soja com o uso da técnica de SR-XRF, que detectou um maior número de íons metálicos na soja transgênica. A seguir, cálcio, cobre e ferro foram quantificados com o uso de uma técnica de espectrometria atômica (ETAAS ou FAAS), naquelas proteínas onde estes foram detectados pela análise qualitativa por SR-XRF. Anteriormente à quantificação, os spots de proteínas passaram pelo processo de decomposição em mini-frascos assistida por radiação microonda, que também foi otimizado neste trabalho. Os resultados da análise quantitativa foram, em grande parte, coerentes com aqueles obtidos pela análise qualitativa e com as informações disponíveis em banco de dados de proteínas, quanto à presença de íons metálicos nas proteínas cuja caracterização foi realizada. As exceções encontradas foram com relação às proteínas glycinin G2 (precursor), na qual a presença de ferro foi confirmada, e à proteína chalcone synthase 2, onde foi confirmada a presença de cálcio, cobre e ferro. Estes resultados, porém, não estão disponíveis no banco de dados de proteínas.This research work consisted of comparison of two kinds of soybeans [Glycine max (L.) Merrill], transgenic and non-transgenic, using proteomics and metalloproteomics changes. Firstly, soybeans proteins were extracted with an extraction buffer containing Tris-HCI (pH 8.8), KCI, DTT, PMSF and SDS, and then they were quantified by the Bradford method. In terms of total protein concentration, both kinds of soybean seed showed a similar result: 8.2 ± 0.3 mg mL for transgenic and 11.0 ± 0.1 mg mL for non-transgenic soybeans. Afterwards, proteins were separated by 2-D PAGE. The electrophorectic process was optimized, in order to obtain gels with a good resolution, and the proteomic profiles of both kinds of soybeans evaluated were compared. In gels having the pl range 4 to 7, transgenic soybeans showed, on average, a greater number of protein spots in the gel (408 ± 27) than did the non-transgenic soybeans (397 ± 26) and the probability of identity between these protein groups was only 35.0%. In another step, 10 protein spots were cut out from the polyacrylamide gel, digested with trypsin, and subsequently characterized by MALDI-TOF MS. LEA protein and early nodulin 75 (precursor) showed differences in their expression, as observed by the different normalized volumes of their spots in the electrophorectic gels of each kind of soybeans. Metal ions such as Ca, Cu, Fe, Mn, Ni and Zn were mapped in some protein spots using the SR-XRF technique, which detected a greater number of metal ions in transgenic soybeans. Calcium, copper and iron were quantified with an atomic absorption spectrometry technique (ETAAS or FAAS) in the proteins where those metal ions were detected by qualitative analysis by SR-XRF. Prior to quantification, protein spots were decomposed by microwave assisted decomposition in mini-vials, a process that was also optimized in this work. Mostly, the results of quantitative analyses agreed with those obtained by qualitative analyses as well as with the information available in the protein data bank about the presence of metal ions in the proteins whose characterization was done. The exceptions found are related to the proteins glycinin G2 (precursor), in which the presence of iron was confirmed, and chalcone synthase 2, in which the presence of calcium, copper and iron was confirmed. Such data, however, are not available in the protein data bank