Production, purificação, characterization and study of the alkaline application of one protease produced by 191 Cellulosimicrobium cellulans.

Cellulosimicrobium cellulans 191 é um microrganismo produtor de um complexo enzimático capaz de degradar a parede celular de leveduras, composto de enzimas b-1,3-glucanases, proteases e quitinases. Este microrganismo adere à célula de levedura e provoca sua lise. C. cellulans 191 foi isolado de resíduos de indústria de fermentação alcoólica. Células desidratadas de Saccharomyces cerevisiae foram usadas no meio de cultura como indutor para a produção da protease. O meio de cultura inicial era composto por 1% de células de S. cerevisiae desidratadas; 13,6 g/L de KH2PO4; 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 4,2 g/L de KOH; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O; 0,001 g/L de Fe2(SO4)3.6H2O; 1 mg/L de biotina e 1mg/L de tiamina. Realizou-se um planejamento experimental fracionário 28-3 cujas variáveis independentes foram os componentes do meio de cultura inicial, este planejamento mostrou que os componentes KH2PO4, KOH e o indutor apresentaram efeito estatisticamente significativo na atividade de protease do meio de cultura. Um planejamento experimental 22 foi realizado usando-se dois fatores, pH e porcentagem de células desidratadas de levedura. Os resultados mostraram que o meio de cultura para a máxima produção de protease seria composto por 8% de células desidratadas de levedura; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 2,0 g/L de (NH4)2SO4 em solução tampão fosfato 0,15 M e pH 8,0. A maior produção de protease foi obtida quando a fermentação ocorreu em temperaturas entre 20 e 27 ºC, após 24 horas de fermentação. A produção da protease foi aumentada cerca de 36 vezes após a otimização do meio de cultura e das condições de fermentação. Para a produção de protease, a linhagem de Cellulosimicrobium cellulans 191 foi fermentada no meio de cultura otimizado em frascos agitados a 27ºC durante 24 horas a 150 rpm. Para a extração da protease extracelular, o sobrenadante do meio de cultivo foi saturado com 40% de sulfato de amônio. O precipitado foi coletado por centrifugação e ao sobrenadante foi adicionado sulfato de amônio até 80% de saturação. O precipitado contendo a protease foi coletado por centrifugação, dialisado e purificado por cromatografia em colunas de DEAE-Sepharose e Q-Sepharose. O fator de purificação obtido foi de 16,8 e o rendimento foi 7,8%. A massa molecular da protease purificada foi estimada em 55 KDa por cromatografia em gel de filtração Sephacryl S-200. A protease apresentou temperatura e pH ótimos de 7,0 a 8,0 e de 50 a 64ºC, respectivamente. A protease foi estável em uma faixa de pH de 4,0 a 7,5 após uma hora a 83ºC quando estabilizada por DTT. Os valores de Km e Vmáx da protease foram 0,027 mg de caseína /mL e Vmáx. de 6,25 U/mg de enzima, respectivamente. A protease purificada foi ativada por 1 mM de FeCl3 e parcialmente inibida por fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSP). A protease purificada foi capaz de lisar células viáveis de Saccharomyces cerevisiae. A aplicação desta protease no isolamento de componentes da parede celular de levedura foi estudada. A glucana é o principal componente da parede celular de Saccharomyces cerevisiae. Nos processos convencionais para o isolamento desse polissacarídeo, são usadas condições de pH extremas que provocam sua degradação. Um método que combina tratamento físico e enzimático utilizando a protease alcalina de Cellulosimicrobium cellulans 191 foi proposto. A glucana foi obtida com pureza de 87,4% e rendimento de 33,7%. Durante este processo, foi facilmente obtida a manana-proteína da parede celular de levedura.Cellulosimicrobium cellulans 191 is a microorganism that produces an enzyme complex capable of disrupting yeast cell walls, which is composed of b-1,3-glucanase, protease and chitinase. This microorganism adheres to yeast cell walls and than lyses them. It was isolated from industrial fermentation sludge. Dried Saccharomyces cerevisiae cells were used in the culture medium as an inductor for protease production. The initial culture medium was composed of 1% of dried cells of S. cerevisiae; 13.6 g/L of KH2PO4; 2.0 g/L of (NH4)2SO4; 4.2 g/L of KOH; 0.2 g/L of MgSO4 .7H2O; 0.001 g/L of Fe2(SO4)3.6H2O; 1 mg/L of biotin and 1mg/L of thiamine. A 28-3 experimental design was performed, the independent variables being the components of the initial culture medium. The components KH2PO4, KOH and the inductor showed a significant effect on the protease activity of the culture medium. A new (22) design was performed using two factors, pH and the percentage of dried yeast cells. The results showed that the culture medium indicated for maximum protease production was composed of 8% of dried yeast cells; 0.2 g/L of MgSO4.7H2O and 2.0 g/L of (NH4)2SO4 in a 0.15M phosphate buffer at pH 8.0. The highest protease production was obtained after 24 hours of fermentation of the microorganism at temperatures between 20 and 27ºC. Protease production was increased about 36 times after optimization of the culture medium and the fermentation conditions. For protease production, Cellulosimicrobium cellulans 191 was grown on the optimized culture medium at 28ºC for 24 hours with agitation at 150 rpm. The cells were collected by centrifugation and 40% of ammonium sulfate added to the supernatant. The precipitate was collected by centrifugation and ammonium sulfate added to the supernatant up to 80% saturation. The precipitate, which contained the protease, was collected by centrifugation, dialyzed and purified by DEAE-Sepharose and Q-Sepharose chromatography. The purification factor was 16.8 and the yield was 7.8%. The molecular mass of the purified protease was estimated at around 55 KDa by gel filtration on Sephacryl S-200. The optimum pH and temperature ranged from 7.0 to 8.0 and from 50 to 64ºC, respectively. When stabilized with DTT, the protease was stable in the pH range from 4.0 to 7.5 for one hour at 83ºC. The kinetic parameters Km and Vmax were 0.027 mg of casein/mL and 6.25 U/mg of enzyme, respectively. The purified protease was activated by 1.0 mM of FeCl3 and partially inhibited by phenylmethylsulfonilfluoride (PMSF). The protease was capable of lysing viable cells of Saccharomyces cerevisiae alone. The application of this alkaline protease in the isolation of yeast cell wall compounds was studied. Glucan is the major component of the Saccharomyces cerevisiae cell wall. Over the last few years, numerous benefits of glucan have been described with respect to human health. Conventional isolation processes involving extreme conditions of pH cause degradation of the polymeric chains. A method combining physical extraction steps and enzymatic treatment using the alkaline protease from Cellulosimicrobium cellulans 191 was proposed in this study, obtaining glucan with a purity of 87.4% and a yield of 33.7%. During this process, the mannoprotein of the yeast cell wall was easily obtained