Caracterização de uma proteina de 35 KDa isolada de mitocondrias de batata com possivel função termogenica

Estudos recentes deste laboratório indicaram que o baixo grau de acoplamento entre a respiração e a fosforiIação oxidativa em mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata parece estar relacionado à existência de uma proteína de aproximadamente 35 KDa presente na membrana interna destas mitocôndrias, com a .propriedade de transportar H+ por um mecanismo sensível a nucleotídeos de purina. No presente trabalho, obtivemos mitocôndrias de batata com controle respiratório mais elevado que em estudos anteriores, graças à modificações introduzidas no procedimento de isolamento. Ainda assim, a velocidade de respiração destas mitocôndrias, no estado IV, foi reduzida pela adição de ATP e ADP, mesmo na presença de carboxiatractilato (CAT). Experimentos de ligação de nucleotídeos de purina mostraram que estas mitocôndrias apresentaram a habilidade de ligar 1,3 nmol ATP.mg proteína; 1,1 nmol -1 . - 1 ADP. mg proteína; 0,7 nmol GTP. mg - 1 proteína. Experimentos de competição mostraram ainda: a maior afinidade de ligação destas mitocôndrias por nucleotídeos de adenina. A construção de um potencial de membrana mais elevado por mitocôndrias de batata e de cole6ptiles de milho é dependente da presença de BSA e nucleotídeos de purina. A presença destes não afeta o potencial construído por mitocôndrias de feijão, beterraba e fígado de rato. Anticorpos contra esta proteína de 35KDa isolada de mitocôndrias de batata foram obtidos e utilizando a técnica de Western Blotting foi verificado que as outras mitocôndrias vegetais em estudo neste laboratórIo como as de coleóptiles de milho, feijão e beterraba possuem esta proteína ou similar como mostrado pela reação cruzada com estes anticorpos. Contrariamente, uma série de mitocôndrias não vegetaIs, taIs como as de fígado de rato, coração bovino e T. Cruzi epimastigotas não mostraram reação com estes anticorpos. Experimentos de reconstituição desta proteína isolada de batata e da UCP isolada de tecido adiposo marrom foram realizados e demonstraram que, no sistema por nós utilizado, elas apresentam comportamento similar, isto é, nas vesículas com proteína incorporada, a velocidade de efluxo de H + foi maior que em vesículas controle, preparadas na ausência de proteína.Early studles from thls laboratory have lndicated that the low degree of coupling between respiration and oxidative phosphorylation in potato mitochondria seems to be related to a 35 KDa protein, present in the inner membrane of those mitochondria, with the ability to translocate H with a: mechanism sensitive to purine nucleotides. In this work, we obtained potato mitochondria with better respiratory control, thanks to modificatlons made in the isolation procedure. In spite of the lsolation method, the respiration rate of these mitochondria ln state IV decreased after additltion of ADP or ATP nucleotides ln the presence of carboxyatractylate (CAT). Binding experiments showed that the mitochondria have the ability to bind 1,3 nmol ATP.mg -1 protein 1,1 nmol ADP. Mg -1 protein; 0,7 nmol GTP. Mg -1proteln. Competition experiments showed the largest affinity of binding of these mltochondria towards adenlne nucleotides. The increase of potato and corn mitochondria membrane potential is dependent on the presence of BSA and purine nucleotides. The presence of BSA and nucleotides dld not affect the membrane potential of red beet roots (Beta vulgaris); bean (Phaseolus vulgaris) and rat liver mltochondria. Antibodies against a 35 KDa protein isolated from potato mitochondria were obtained and, using the Western blotting techique, we verified that the other plant mitochondria in studies in this laboratory, such as corn, red beet roots and bean, have this or a similar protein as shown by cross reactivity wlth these antibodies. In contrast a series of non-plant mitochondria, also studied in thls laboratory, such as those from rat liver, beef heart and T. cruzi epimastigotes did not show cross reactivity with these antibodies. Reconstitution experiments of this protéln and of UCP isolated from brown adipose tissue were performed and showed that, in the system used, they have similar behavior. In the vesicles with protein incorporated, the rate of H+ efflux was larger than in control vesicles, prepared without either protein