Isolamento, purificação e caracterização bioquimica e farmacologica de toxinas obtidas do veneno de Micrurus dumerilli carinicauda

O veneno da serpente elapídica Micrurus dumerilii carinicauda apresenta uma ação neurotóxica caracterizada por bloqueio da resposta contrátil em preparação de ave e mamíferos in vitro (SERAFIM et al., 2002). Através de cromatografia em HPLC de coluna fase reversa o veneno foi fracionado e dentre os 22 picos obtidos foram caracterizados bioquímica e farmacologicamente somente aqueles que exibiram atividade neurotóxica do tipo bloqueadora neuromuscular. Assim, os picos que exibiram atividade neurotóxica foram a PLA2 MiDCAI correspondente ao pico 16 e duas isoformas (as subfrações F6 e F7) correspondentes aos picos 6 e 7 e que determinaram bloqueio neuromuscular em preparações de camundongo. A PLA2 MiDCAI, que possui massa molecular de 15.552 Da e um pI de 7.8 compartilha uma alta homologia com outras PLA2 neurotóxicas MICNI A (77,68%) e B (73,12%) do veneno da serpente (Naja nigricollis). Em preparação músculo biventer cevicis de pintainho MiDCAI (2.4 µM) induziu 50% bloqueio em 30 ± 5 min inibindo completamente a resposta contrátil a estímulos indiretos em 120 min de observação. Além disso, as contraturas determinadas pelo carbacol (8 mM) e KCl (20 mM) em preparação biventer cervicis de pintainho permaneceram inalteradas na vigência do bloqueio neuromuscular completo, sugerindo uma ação do tipo pré-sináptica. Na preparação nervo frênico-diafragma de camundongo MiDCAI (0.6, 1.2, 2.4 µM) induziu alteração trifásica na resposta contrátil. Além disso, o registro intracelular dos potenciais de placa terminal em miniatura (PPTM) e potenciais de placa terminal (PPT) mostrou também que a MiDCAI causou uma alteração trifásica na freqüência dos PPTM além de aumentar o conteúdo quântico do controle para 386 ± 12% aos 10 min de incubação (n=14, p<0.05). O registro extracelular do potencial de ação composto do nervo ciático de camundongo mostrou que esta neurotoxina induz um aumento na amplitude desses potenciais (30 ± 9%, 0.6 µM, p<0.05) semelhante ao induzido pela 3,4-diaminopiridina (3,4-DAP) 10 µM. Também ficou claro que o efeito facilitador induzido por esta PLA2 esteja relacionado ao bloqueio de canais de potássio como demonstrado pelo bloqueio de 31 ± 1% (2.4 µM, p<0.05) das correntes de potássio evocadas em neurônios do gânglio da raiz dorsal usando-se a técnica de patch-clamp. Já as subfrações ativas F6 e F7 possuem um peso molecular de aproximadamente 14 kDa como ficou demonstrado pela eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5 %. Em preparações neuromusculares de camundongo estas duas isoformas induziram bloqueio neuromuscular irreversível a estímulos elétricos indiretos. Assim, um bloqueio de 50% da resposta contrátil foi obtido em aproximadamente 18 min quando estas toxinas foram ensaiadas a 5 µg/ml promovendo bloqueio completo em aproximadamente 55 min. Sucessivas lavagens da preparação e a adição de neostigmina (6 µM) e 3,4-DAP (10 µM) foram ineficazes em reverter o bloqueio neuromuscular instalado. Também não houve alteração da resposta aos estímulos diretos nem redução da polaridade da membrana da fibra muscular quando estas toxinas foram ensaiadas na concentração de 5 mg/ml. Em conclusão, a PLA2 MiDCAI é uma nova neurotoxina pré-sináptica que induz alteração trifásica em preparações neuromusculares de camundongo promovendo uma facilitação inicial e fugaz possivelmente causada pelo bloqueio de canais de potássio no terminal nervoso motor. Já, as características bioquímicas assim como os efeitos neuromusculares desencadeados pelas subfrações F6 e F7 sugerem se tratar de duas isoformas curaremiméticas ou do tipo a-neurotoxinas, como demonstrado para outros venenos elapídicos.We have isolated a new PLA2 (MiDCAI) and two curaremimetic isoforms (F6 and F7) from the venom of Micrurus dumerilii carinicauda. With a molecular mass of 15.552 Da, MiDCA1 shared high sequence homology with MICNI A and B from Naja nigricollis venom showing a sequential and structural homology of 77.68 and 73.12%, respectively. Pharmacological tests showed a concentration dependent effect on nerve evoked twitches in both mammal and avian preparations. On mouse phrenic-nerve diaphragm preparation MiDCAI (2.4 mM; n=6) caused triphasic changes in twitch tension. On chick preparations complete blockade of the twitches occurred after 120 min (2.4 mM; n=6, p<0.05), while contractures elicited by exogenous applied carbachol (8 mM) and KCl (20 mM) remained unaltered. Intracellular recordings of endplate potentials (EPPs) and miniature endplate potentials (MEPPs) from mouse diaphragm preparations revealed that MiDCAI increased quantal content to 386 ± 12% of control after 10 min, (n=14; p<0.05) and caused a triphasic change in the frequency of MEPPs. Extracellular recordings of mouse sciatic-nerve compound action potentials revealed that MiDCAI increased the amplitude of compound action potentials (30 ± 9%, 0.6 µM, p<0.05). Potassium currents elicited in freshly dissociated DRG neurones were significantly blocked by 31 ± 1% (p