Aspectos celulares da cartilagem epifisaria de rãs : elementos envolvidos nos processos de calcificação e crescimento osseo

Os anfibios anuros ocupam uma posição inferior na escala evolutiva dos vertebrados e, além disso, apresentam uma postura de repouso e um modo de locomoção bem característico. Estas características certamente influenciam a estrutura, composição e organização da matriz extracelular dos ossos, cartilagens e tendões. Estudos sobre a estrutura da cartilagem epifisária destes animais têm revelado que esta cartilagem difere em vários aspectos do modelo descrito para aves e mamíferos. As duas principais diferenças consistem na localização da cartilagem de crescimento no interior do tubo ósseo metafisário e na existência de uma expansão lateral da cartilagem articular, cobrindo a face externa da extremidade do osso periosteal. Os estudos realizados por diferentes autores sugeriram a existência de um mecanismo de crescimento ósseo menos dependente da cartilagem de crescimento e mais relacionado com a atividade dos osteoblastos no periósteo. Ou seja, o crescimento longitudinal dos ossos longos ocorre por ossificação periosteal e não por ossificação endocondral. Além disso_ foram encontrados_ nos anuros, sítios ectópicos de calcificação na cartilagem articular. Considerando que estas características dos anuros diferem enormemente dos modelos conhecidos para aves e mamíferos, fazia-se relevante um estudo mais detalhado sobre a estrutura da cartilagem epifisária e sobre o crescimento dos ossos longos destes animais. Neste sentido, este projeto teve por objetivo caracterizar os aspectos celulares das diferentes regiões da cartilagem epifisária de Rana catesbeiana envolvidos com o crescimento ósseo e com a calcificação da cartilagem articular. Especial atenção, portanto, foi dispensada às características dos condrócitos da cartilagem de crescimento e dos osteoblastos no periósteo. Para isto, foram empregadas análises citoquímicas, cito químicas enzimáticas, imunocitoquímicas, de incorporação de marcadores de cálcio fluorescentes e de morte celular, além de análises ultra-estruturais. Os resultados obtidos, apresentados na forma de artigos, demonstraram que: 1) em Rana catesbeiana, entre a face interna da projeção lateral da cartilagem articular e a face externa da extremidade do osso periosteal, existe uma estrutura fibrosa complexa e especializada, denominado ligamento osteocondral. Este ligamento é constituído de duas regiões distintas, com células e matriz extracelular diferenciadas, exibindo um arranjo de fibras de colágeno e de células que permite a esta estrutura, ao mesmo tempo, garantir uma firme e flexível ancoragem da cartilagem articular no osso periosteal e promover o crescimento ósseo em comprimento e espessura; 2) a ossificação endocondral é um evento tardio e não desempenha um papel essencial no desenvolvimento e crescimento dos ossos longos nestes animais. Entretanto, quando estes animais crescem e ganham peso, aparentemente, a ossificação endocondral está presente, reforçando as extremidades ósseas. Além disso, a hipertrofia e morte dos condrócitos bem como a atividade de fosfatase alcalina e a calcifícação da matriz extracelular não estão diretamente associadas entre si e nem à formação de trabéculas ósseas; 3) a calcificação da cartilagem articular é um processo fisiológico nestes animais, aparecendo logo após a metamorfose e sendo estimulada por forças de compressão. Além disso, esta calcificação parece estar relacionada à formação de uma estrutura similar ao centro secundário de ossificação, encontrado nos animais com 4 anos pós-metamorfoseAnurans are in a lower phylogenetic position when compared to birds and mammals. Furthermore, anurans present very distinct movement and posture behavior, which obviously affect the structure, composition and organization of the extracellular matrix of tendons. Studies about the structure of anuran epiphyseal cartilage have shown that this cartilage differs in several aspects from those found in birds and mammals. The two main differences are: the growth cartilage is localized inside the bone metaphyseal tube and there is a lateral expansion of articular cartilage, covering the externa I surface of the periostal bone. Different authors suggested the existence of abone growth mechanism independent of growth cartilage and more related to the osteoblasts activity on the periosteum. 1t means that the longitudinal growth of long bones occurs by periostea1 ossification rather than by endochondral ossification. Furthermore, in the anuran, ectopic sites of calcification were found in the articular cartilage. Considering that the anuran cartilage differs of the avian and mammalian counterparts, we decided to perform a detailed study on both the epiphyseal cartilage structure and the long bone growth in these animals. In this sense, this work characterized the cellular aspects of different regions of the epiphyseal cartilage of Rana catesbeiana involved with the bone growth and with articular cartilage calcification. Special attention was given to the characteristics of the growth cartilage chondrocytes and to the osteoblasts in the periosteum, using cytochemical analysis, enzymatic cytochemistry, immunocytochemistry, calcium probes, DNA fragmentation test and ultrastructural analysis. The results showed that: 1) there is a complex and specialized fibrous attachment (the osteochondralligament) in Rana catesbeiana, that anchors the inner face of the lateral articular cartilage expansion and the outer face of the periosteal bone end. This ligament has two distinct regions with different arrangements of the collagen fibers and cells, which warrant a strong and flexible anchorage of the articular cartilage to the periosteal bone, besides playing a role of periosteum and contributing to the growth of the long bones; 2) endochondral ossification is a late event and does not play an essential role in the developrnent and growth of long bones in R. catesbeiana. However, as the animals grow older and gain weight, further reinforcement of the bone ends is apparent1y necessary and endochondral ossification takes place. Furthermore, the chondrocyte hypertrophy and death as well as alkaline phosphatase activity and matrix calcification are neither directly associated to each other nor to the formation of endochondral bone; 3) Calcification of the articular cartilage is a non-pathological process that occurs after metamorphosis and is apparently stimulated by mechanical loading. Besides, this calcification precedes the formation of a similar structure to a secondary center of ossification of mammals, found in 4-year-old individual