Analise proteomica da Xylela fastidiosa e desenvolvimento de novo metodo para analise quantitativa de proteomas por espectrometria de massa

A bactéria Xy/ella fastidiosa é responsável por várias doenças de plantas economicamente importantes, incluindo a clorose variegada do citros (CVC). Apesar de seu genoma já estar completamente sequenciado, os estudos das proteínas expressas pela bactéria são quase inexistentes. Na presente tese, foi utilizada a eletroforese de duas dimensões em combinação com a espectrometria de massas para identificar os produtos de 142 diferentes genes da X. fastidiosa, incluindo proteínas secretadas e as relacionadas com adesão, que apresentam particular interesse para o estudo da patogenicidade. Análise comparativa do perfil protéico da bactéria crescida como colônias isoladas em meio sólido de cultura com o da bactéria formando biofilme em meio líquido de cultura indicou a expressão específica de uma cisteíno protease, uma lipase e uma isoforma da subunidade da fímbria do tipo IV na condição de formação de biofilme. Análise do índice de uso de códons específicos ("codon bias") das proteínas mais expressas no extrato celular total revelou uma distribuição de valores inesperadamente baixa, o que é proposto como sendo possível causa da natureza fastidiosa da X. fastidiosa. Um banco de dados disponibilizando as informações geradas foi construído e pode ser acessado pela intemet: URL: www.proteome.ibLunicamp.br. Os resultados representam um esforço inicial para a caracterização da expressão de proteínas na X. fastidiosa e devem ajudar a promover um maior entendimento dos mecanismos de sobrevivência, adesão e secreção, bem como viabilizar subsequentes estudos de análise diferencial do proteoma da X. fastidiosa em diversos modelos experimentais. Na segunda parte da tese é mostrado um novo método para análise quantitativa de proteomas por espectrometria de massas. A estratégia proposta se baseia em marcar duas amostras a serem comparadas com diferentes formas isotópicas do reagente ICA T ("Isotope Coded Afinity Tags"), comigrá-Ias num único gel 2DE e identificar e quantificar as proteínas por espectrometria de massas. Os resultados mostram que proteínas rotuladas com as formas isotopicamente pesada e normal do reagente ICA T comigram na mesma posição em géis 2DE. Quando as proteínas são subsequentemente digeridas e analisadas por espectrometria de massas, a razão da abundância relativa das proteínas em cada amostra pode ser determinada precisamente, baseando-se nas intensidades relativas do sinal espectro métrico dos peptídios contendo as diferenças isotópicas. Utilizando esta estratégia, foi possível realizar quantificações com precisão melhor que 20 %The bacteria Xy/ella fastidiosa is the causative agent of a number of economically important crop diseases, including citrus variegated chlorosis (CVC). Although its complete genome is already sequenced, X. fastidiosa is poorly characterized by biochemical approaches at the protein level. In the present work it was used two dimensional electrophoresis in combination with mass spectrometry to identify the products of 142 different X. fastidiosa genes, including secreted and adhesion related proteins that show particular interest for the study of pathogenesis. Comparative proteome analysis of the bacteria grown as isolated colonies on a solid culture medium and the bacteria forming biofilm on a liquid culture medium indicated the specific expression of a cysteine protease, a lipase and an isoform of the type IV fimbriae subunit in the biofilm forming condition. A codon usage analysis of the most expressed proteins from the whole cell extract revealed a low biased distribution, which we propose to be related with the slow growing nature of X. fastidiosa. A database of the X. fastidiosa proteome was developed and can be accessed via the intemet (URL: www.proteome.ibLunicamp.br). The results represent an initial effort to characterize protein expression in X. fastidiosa and should contribute for a better understanding of the survival, adhesion and secretion mechanisms. It also provides the basis for subsequent differential proteome analysis on various experimental models. The second part of the thesis presents a new method for quantitative proteome analysis using mass spectrometry. The proposed strategy is based on labelling two different samples to be compared with the different istopic forms of the ICA T (Isotope Coded Afinity Tags) reagent, combine and comigrate them in a single 2DE gel and identify and quantify the proteins by mass spectrometry. It is shown that proteins labeled with the isotopically heavy and normal forms of the reagent co-migrate in 2DE gels and that the ratio of protein abundance can be accurately determined from the rein active mass spectrometric signal intensities of the heavy and normal forms of labeled, cysteine containing peptides. 80th identification and accurate quantification (better than 20 %) are therefore achieved in a simple single-step analysi